[發明專利]耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶基因及其編碼的多肽和制備方法

無效

• 申請號: 02111361.0
• 申請日: 2002-04-12
• 公開（公告）號: CN1382804A
• 公開（公告）日: 2002-12-04
• 發明（設計）人: 包其郁;李蔚;林霞;汪建;于軍
• 申請（專利權）人: 杭州華大基因研發中心
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12N15/63
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 林懷禹

?????????????????????????技術領域

本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶基因及其編碼的多肽和制備方法。

?????????????????????????背景技術

Phosphoribosylanthranilate?isomerase(PRAI)，E.C.5.3.1.24，中文名稱為磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶。此酶催化色氨酸生物合成的第四步反應，即將5′-磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸轉變為1-(o-羧苯氨基)-1-脫氧核酮糖5-磷酸(CdRP)。

在大多數的嗜熱微生物中是單體的，也是不穩定的。但是在嗜熱菌Thermotoga?maritima中它是二聚體和穩定的(tPRAI)。tPRAI的兩個亞基是背靠背的由一個疏水的環連在一起。合理設計的tPRAI單體變異體已經測到二聚作用對于熱穩定性。

嗜熱微生物的新陳代謝可以在接近100攝氏度的條件下正常進行，這是由于它們有熱穩定酶和處理不穩定代謝物的機制。蛋白質的熱穩定性的結構基礎具有重要的科研價值。來自于嗜熱微生物同源蛋白的X射線衍射結構的不同可以看出起關鍵作用的穩定交互作用。為了達到這個目的，Hennig?M等人利用同型代換的方法得到的噬菌體研究了Thermotoga?maritima的磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶(tPRAI)二聚體的晶體結構，得到的精度可達2.0。tPRAI的亞基是完全的TIM-或者(βα)8-barrel的折疊，而大腸桿菌ePRAI的α螺旋被一個環所取代。tPRAI的亞基之間通過它們中心beta-barrels的氮端的面相連。兩個長的相互對稱的在其他亞基的空穴中反向突出的環有助于多疏水作用。在tPRAI中，氮端甲硫氨酸的邊鏈和兩個亞基的碳端的異亮氨酸被固定在一個疏水簇中，鹽橋的數量也有所升高。這些特征似乎是tPRAI的高熱穩定性的主要原因。與其他的超熱穩定酶相比，tPRAI在25℃時的催化作用比ePRAI效率高，這主要是因為它底物的米氏常數值低。

擬南芥色氨酸的生物合成途徑中的這個酶是由一個基因家族編碼的。He?Y等人觀察了每一個PRAI的同工基因的表達模式。結果表明，三個同工基因在正常的生長條件下是分別受到調控的。第一，PRAI1和PRAI3的表達量比PRAI2大約高10倍；第二，三個同工基因對環境壓力的反應是不同的，PRAI2對壓力的反應比另兩個更強；第三，這三個基因的表達具有組織和細胞特異性；第四，PRAI同工基因的表達是與擬南芥的正常生長和發展相協調的。

騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter?tangcongensis)，是生活在我國云南省騰沖縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它由中國科學院微生物所首先發現并進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4^T(Chinese?collection?of?microorganisms?AS?1.2430^T＝JCM?11007^T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶也具有自己特有的結構。

?????????????????????????發明內容

本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶活性的多肽的核苷酸序列。

本發明的目的之二是提供一種分離的具有耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶活性多肽。

本發明的另一目的還提供了嗜熱厭氧菌的磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶重組載體、含有重組載體的宿主細胞，以及制備蛋白的方法。

本發明一方面提供一種能編碼具有耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶相關。核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括：缺失、無義、插入、錯義。

本發明另一方面提供了一種耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶活性的多肽。該多肽具有SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本發明它提供了制備耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶的方法包括以下步驟：

1)分離出編碼耐高溫磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶的核苷酸序列SEQ?IDNO.1；