[發明專利]新型腫瘤凋亡素2配體基因、其表達的腫瘤凋亡素及其制法

無效

• 申請號: 02110880.3
• 申請日: 2002-02-22
• 公開（公告）號: CN1367248A
• 公開（公告）日: 2002-09-04
• 發明（設計）人: 王梁華;焦炳華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;A61K38/17;C07H21/04;C07K14/435
• 代理公司: 上海德昭專利事務所
• 代理人: 程宗德

技術領域

本發明涉及醫藥生物工程技術領域，是從中國人外周血單個核細胞中獲得的一種新型的腫瘤凋亡素2配體基因，并利用該基因制備人可溶性腫瘤凋亡蛋白——腫瘤凋亡素的方法。

背景技術

1995年，國外報道從人表達標簽序列文庫(expressed?sequence?tag，EST)中篩選到一種編碼抗腫瘤蛋白的基因(GenBank?No.：U57059；U37518；NM003810；XM?045049)，該基因編碼的蛋白質稱為腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor?necrosis?factor-relatedapoptosis-inducing?ligand，TRAIL)，又稱腫瘤凋亡素2配體(apoptotin-2?ligand，簡稱Apo-2L)，是腫瘤壞死因子(tumor?necrosis?factor，TNF)家族成員之一，其可有效地誘導腫瘤和轉化細胞凋亡，而對正常細胞無影響。人Apo-2L基因的編碼序列有843個核苷酸，核苷酸序列見GenBank?No.：U57059；U37518；NM?003810；XM?045049，編碼的蛋白質Apo-2L由281個氨基酸組成。業已證明Apo-2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第114位開始的胞外區可形成游離的可溶性腫瘤凋亡素蛋白Apo-2L₁₁₄，也稱TRAIL₁₁₄，同樣具有腫瘤凋亡作用。目前國內外對Apo-2L₁₁₄的制備都使用Apo-2L基因。然而由于進行原核重組表達Apo-2L₁₁₄時，所使用的是商品化表達載體，如pET(Novagen公司)或pEQ(Qiagen公司)等，重組蛋白呈包涵體，其必須經復性才有可能表現生物學活性，而復性過程是比較困難和不穩定的，且不是所有的包涵體都可復性的。

發明內容

本發明從中國人外周血單個核細胞中獲得了一種新型腫瘤凋亡素2配體基因，稱其為Apo-2L?I基因。Apo-2L?I基因的編碼序列由801個核苷酸組成，與已有的Apo-2L基因相比，除了少了位于后者編碼區5’端第271～313位的42個核苷酸外，其余部分基本相同，即使個別核苷酸不同，也不改變編碼的相應氨基酸，Apo-2L?I基因的核苷酸序列見表1。由Apo-2L?I基因編碼的蛋白相應也少了14個氨基酸，由267個氨基酸組成，氨基酸序列見表2。其與Apo-2L一樣具有使腫瘤細胞凋亡的作用。

本發明用Apo-2L?I基因來制備人可溶性腫瘤凋亡素。以Apo-2L?I基因為模板，通過PCR擴增，從編碼序列5’端第297-801位核苷酸得到人可溶性腫瘤凋亡素基因，其編碼的氨基酸相當于Apo-2L?I蛋白N-端第100～267位氨基酸，故稱其為Apo-2L?I₁₀₀基因，其與Apo-2L₁₁₄基因一樣，由504個核苷酸組成。其編碼的蛋白與Apo-2L?I₁₁₄相同，也由168個氨基酸組成，稱之為Apo-2L?I₁₀₀或腫瘤凋亡素。

制備Apo-2L?I₁₀₀所使用的表達載體為pBV220。pBV220由中國預防醫學科學院病毒研究所提供，該載體是溫控型的原核表達載體，其表達量較高。本發明通過合成寡聚核苷酸，置換原pBV220載體Bg1II與Xmn?I之間的序列，所構建的表達載體命名為pBV-Apo-2L?I₁₀₀，該質粒轉化大腸桿菌，所得的工程菌能直接表達具有生物學活性的Apo-2L?I₁₀₀。使Apo-2L?I₁₀₀表達量占工程菌總蛋白的40％以上，占破碎后工程菌上清總蛋白的10％以上，大大提高了腫瘤凋亡素Apo-2L?I₁₀₀的產量和質量，且制備方法簡便。

本發明Apo-2L?I基因的克隆，Apo-2L?I₁₀₀的制備，具體包括如下步驟：

一、構建cDNA文庫，制備Apo-2L?I基因

1.制備人外周血單個核細胞總RNA

(1)按常規方法從中國人外周血中分離淋巴細胞，進而用貼壁法獲得單個核細胞；

(2)用細菌內毒素激活單個核細胞以刺激細胞提高RNA的豐度，再用RNA抽提試劑盒(Qiagen公司)抽提總RNA。

2.篩選Apo-2L?I基因

(1)構建cDNA文庫