[發(fā)明專利]環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、脫氧核酶及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 02109145.5
• 申請(qǐng)日: 2002-02-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1377961A
• 公開(kāi)（公告）日: 2002-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張今;陳非;王曉平;孔祥鐸;茍小軍;朱師珍;李爽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/55;A61K38/46;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 長(zhǎng)春吉大專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 王恩遠(yuǎn),張景林

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一類新型結(jié)構(gòu)的核酶和脫氧核酶的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及其在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用。具體說(shuō)是利用體外定向進(jìn)化以及克隆等技術(shù)，有效地在核酶和脫氧核酶的配對(duì)結(jié)構(gòu)域兩側(cè)引入一段輔助核酸序列，使其構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

核酶、脫氧核酶是有酶催化活性的核酸小分子，其最大區(qū)別在于核酶是RNA分子，脫氧核酶為DNA分子。目前，它們主要應(yīng)用于基因治療中的反義療法，其基本原理是：借助核酶和脫氧核酶特異性地切割靶mRNA，阻斷某種蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而阻遏或降低目的基因的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到治療疾病的作用。

核酶、脫氧核酶在醫(yī)療中應(yīng)用的最大的挑戰(zhàn)是其體內(nèi)傳遞問(wèn)題，即這些分子如何被運(yùn)送到它們的目標(biāo)RNA分子所在的位置：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。目前核酶(脫氧核酶)等寡核苷酸的體內(nèi)傳遞形式主要可以分為兩類，一是病毒介導(dǎo)的傳遞，僅適用于核酶，另一類是非病毒方法，用物理或者化學(xué)方法進(jìn)行核酸的傳遞，脫氧核酶和化學(xué)合成的核酶均適用于此方法。前者傳遞效率高，并且核酶可以穩(wěn)定地在目的細(xì)胞中表達(dá)，作用時(shí)間長(zhǎng)，但其存在免疫原性，在生物體內(nèi)的毒副作用也需進(jìn)一步研究；后者避免了野生型病毒對(duì)人體的污染，不會(huì)影響正常的基因表達(dá)，但傳遞效率低、體內(nèi)穩(wěn)定性差。

核酶、脫氧核酶在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性是其應(yīng)用中的又一瓶頸。這是因?yàn)榫€性核酶、脫氧核酶被導(dǎo)入細(xì)胞后，極易被內(nèi)源性RNA、DNA水解酶降解，影響反義治療的效果。穩(wěn)定性問(wèn)題可以通過(guò)對(duì)核酶、脫氧核酶進(jìn)行修飾而加以改善。傳統(tǒng)的辦法主要是對(duì)核酸的磷酸骨架進(jìn)行硫代、甲基化、氨基化等化學(xué)修飾或改變核酸分子元件的手性來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是即使將幾乎所有核苷酸的磷酸全部進(jìn)行硫代修飾，其在50％人血清中穩(wěn)定存在時(shí)間也不超過(guò)一周。并且由于化學(xué)修飾，酶活力下降許多。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還表明化學(xué)修飾會(huì)增大核酸毒副作用，并使其代謝速度加快，半衰期縮短。

本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酶和脫氧核酶，使之具有在生物體內(nèi)傳遞效率高、穩(wěn)定性高等性能。

本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、脫氧核酶使我們可以有效克服目前兩種傳遞形式所存在的有毒副作用和免疫原性、傳遞效率低等缺點(diǎn)，并為開(kāi)發(fā)新的傳遞載體系統(tǒng)開(kāi)辟了一個(gè)新方向。另外，本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)狀單鏈核酶、脫氧核酶結(jié)構(gòu)還可以極大地提高其在生物體內(nèi)穩(wěn)定性，并避免了化學(xué)修飾所帶來(lái)的毒副作用。此外，這是完全不同于傳統(tǒng)核酶、脫氧核酶線性結(jié)構(gòu)的一種全新環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它為核酶、脫氧核酶今后的發(fā)展拓展了更為廣闊的空間。特別對(duì)于脫氧核酶而言，其意義更為重大。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)脫氧核酶為線性DNA分子，無(wú)法借助載體實(shí)現(xiàn)自我傳代，極大地影響了其在體內(nèi)的傳遞和穩(wěn)定性。

環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以極大地提高了核酶、脫氧核酶在生物體內(nèi)穩(wěn)定性，并為解決它們?cè)隗w內(nèi)傳代和傳遞問(wèn)題開(kāi)辟了一條新路。

圖1：環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、脫氧核酶結(jié)構(gòu)圖

圖2：環(huán)狀核酶體外進(jìn)化原理示意圖

圖3：環(huán)狀核酶體外進(jìn)化路線圖

圖4：環(huán)狀核酶、脫氧核酶細(xì)菌抑制曲線圖

本發(fā)明中環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、環(huán)狀脫氧核酶的結(jié)構(gòu)如附圖1所示，核酶及脫氧核酶經(jīng)由體外定向進(jìn)化或克隆技術(shù)得到。

環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、環(huán)狀結(jié)構(gòu)脫氧核酶由三部分構(gòu)成，E為催化結(jié)構(gòu)域，B1、B2為配對(duì)結(jié)構(gòu)域之兩臂，C為輔助核酸序列，起維系核酶及脫氧核酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)與剛性的作用。

對(duì)于環(huán)狀核酶，其催化結(jié)構(gòu)域RNA分子可以與錘頭核酶相一致，亦可以與發(fā)夾核酶等其他能切割RNA的核酶相一致，以錘頭核酶效果最佳。對(duì)于環(huán)狀脫氧核酶，其催化結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA分子，以10-23結(jié)構(gòu)效果最佳，亦可以與其他能切割RNA的脫氧核酶相一致。配對(duì)結(jié)構(gòu)域DNA、RNA分子均可，以DNA分子為佳。配對(duì)結(jié)構(gòu)域隨切割底物變化而變化，兩臂臂長(zhǎng)要比線性核酶、脫氧核酶長(zhǎng)一些，10-15mer為佳。輔助核酸序列為DNA分子，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、脫氧核酶所獨(dú)有。

核酶(脫氧核酶)主要應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域的人類疾病治療，如腫瘤、病毒感染性疾病(HIV、HPV、HCV等)和某些遺傳病等。另外，其在防治動(dòng)、植物病毒侵害以及基因組研究等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中也有一定的應(yīng)用。我們將本發(fā)明中的兩種環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、脫氧核酶應(yīng)用于抗細(xì)菌耐藥性的應(yīng)用研究中，得到了滿意的結(jié)果。

總之，本發(fā)明所構(gòu)建一類全新環(huán)狀結(jié)構(gòu)核酶、脫氧核酶，具有可以解決目前其在應(yīng)用中所遇到的傳代、傳遞和穩(wěn)定性等問(wèn)題的優(yōu)良性能，并能夠?qū)⑵溥M(jìn)一步應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療領(lǐng)域。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1：環(huán)狀核酶的體外進(jìn)化篩選1.實(shí)驗(yàn)材料與原理

實(shí)驗(yàn)原理如附圖2(1)DNA、RNA的合成