[發(fā)明專利]人核糖核酸酶U和人溶菌酶的兩種進化酶

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 02109123.4
• 申請日: 2002-01-30
• 公開（公告）號: CN1377960A
• 公開（公告）日: 2002-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張今;王曉平;茍小軍;孔祥鐸;李爽;朱師珍
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N9/36;C12N15/63;C12N15/55;C12N15/56;A61K38/46;A61K38/47
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 王恩遠,張景林

本發(fā)明涉及一類定向進化制備的進化酶，特別是涉及由人核糖核酸酶U和人溶菌酶通過定向進化制備的人核糖核酸酶U進化酶和人溶菌酶的進化酶。

近年來，隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)的日新月異，以酶為主要研究對象的蛋白質(zhì)工程技術(shù)發(fā)展非常迅速。在蛋白質(zhì)工程研究方面，有關(guān)分子工程制備的進化酶、模塊酶和雜合酶的研究日益受到重視。尤其是表達克隆(expression?cloning)、分子篩選(molecular?screening)、人工進化(artificial?evolution)、DNA改組(DNA?Shuffling)和體外突變技術(shù)開發(fā)的成功，為定向進化制備進化酶的開發(fā)與生產(chǎn)鋪平了道路。

天然蛋白質(zhì)功能的進化有一部分是通過結(jié)構(gòu)域或亞結(jié)構(gòu)域的重組來實現(xiàn)的，例如底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域這些相互獨立的結(jié)構(gòu)域之間的重組。這不但可以進化某種功能，還可以創(chuàng)造出新的功能，因為酶的活性位點位于不同的折疊單位相互作用的界面上。

基因工程與蛋白質(zhì)工程應(yīng)用于酶學(xué)的主要目的是通過改變天然酶的特性，創(chuàng)造具有新特性或性能有所改善的酶。獲得新酶的原因有許多方面：(1)天然酶在現(xiàn)存的工業(yè)條件下(例如在有機相、極端溫度和pH)的穩(wěn)定性較差或其催化效率很低；(2)天然酶在工程菌中的折疊效率較差或?qū)Φ鞍酌该舾校?3)酶的催化活性需要提高或降低；(4)需要創(chuàng)造具有新反應(yīng)活性的酶。定向進化制備的進化酶主要應(yīng)用于：改變酶的非催化特性；創(chuàng)造具有新活性的酶；研究酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系等。在新酶的開發(fā)和現(xiàn)有酶的改造利用方面，定向進化技術(shù)顯示了它巨大的應(yīng)用前景。

對酶的分子改造，幾十年來的工作都著眼于兩個方面，一是基于序列的合理化設(shè)計方案(Sequential?rational?design)，如化學(xué)修飾，定點突變(site-directed?mutagenesis)等。一是利用基因的可操作性，模擬自然界的演化進程的非合理化設(shè)計方案(irrational?design)，如定向進化(directedevolution)，雜合進化(hybrid?evolution)等。對酶分子的研究可以分為認識和改造兩個方面。前者是利用各種生物化學(xué)，晶體學(xué)，光譜學(xué)等方法對天然酶或其突變體進行研究，獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系以及氨基酸殘基功能等方面的信息。以此為依據(jù)對酶分子進行改造，稱為酶分子的合理性設(shè)計。與此相對應(yīng)，不需要準確的酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過隨機突變，基因重組，定向篩選等方法對其進行改造，則稱為酶分子的非合理性設(shè)計。非合理性設(shè)計的實用性較強，往往可以通過隨機產(chǎn)生的突變，改進酶的特性。對酶分子的設(shè)計與改造方法，是基于基因工程、蛋白質(zhì)工程和計算機技術(shù)互補發(fā)展和滲透的結(jié)果。它標志著人類可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至設(shè)計出自然界中原來并不存在的全新的酶分子。在目前，酶的分子工程改造還不成熟的情況下，通過定點突變技術(shù)改造成功了大量的酶分子，獲得了比天然酶活力更高，穩(wěn)定性更好的工業(yè)用酶。但總體說來，我們的能力并未達到對復(fù)雜的生物體系進行有效的人為改造的水平。近年來，易錯PCR，DNA?shuffling和高突變菌株等技術(shù)的應(yīng)用，在對目的基因表型有高效檢測篩選系統(tǒng)的條件下，建立了酶分子的定向進化策略，盡管不清楚酶分子的結(jié)構(gòu)，仍能獲得具有預(yù)期特性的新酶，基本上實現(xiàn)了酶的分子改造。