[發明專利]利用轉基因生菜生產人胰島素的方法

無效

• 申請號: 02104176.8
• 申請日: 2002-03-15
• 公開（公告）號: CN1382734A
• 公開（公告）日: 2002-12-04
• 發明（設計）人: 林忠平;倪挺;胡鳶雷;高音
• 申請（專利權）人: 林忠平
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C12N15/09;C12N15/82
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明是利用生菜做為一種植物生物反應器來制造人胰島素。這種人胰島素可以通過生食生菜，做為一種口服制劑通過消化道上皮粘膜進入體內，改善糖尿病病人的自體免疫狀況。同時也可以從這種生菜提取高表達量的人胰島素，而獲得注射用人胰島素。

本發明的主要創新之點在于(1)選用植物偏愛的密碼子，人工合成人胰島素基因；(2)在合成人胰島素的C端加上了KDEL內質網滯留序列，避免了胰島素在植物細胞中的降解。

在植物生物反應器研究中利用馬鈴薯塊莖生產乙肝疫苗的研究已受到廣泛的重視。生菜做為可生食的蔬菜或果品，用它來生產口服的多肽類藥物具有很大的應用潛力。人胰島素對于胰島素依賴的尿病患者的治療是十分重要的。某些糖尿病患者的代謝調節與自體免疫功能相關。口服胰島素已被證明對某些類型的尿病治療是有效的〔Reddy?S?et?at，Pancreas2000，20(1)：55-60；Ploix?C?et?at，Diabetes?1999，48(1)2150-6；Ramiya?VK，Maclaren?NK，Horm?Res?1997，48?suppl?4：67-70〕。

本項發明的技術要點之一是胰島素基因的人工合成。之所以不采用天然人胰島素的DNA序列，是因為我們采用植物偏愛的密碼子可提高該基因在植物中的表達量。我們所用的人胰島素基因編碼了天然胰島素A鏈和B鏈的氨基酸順序，但DNA順序與天然人胰島素基因的DNA順序并不相同。

本項發明的要點之二是植物表達載體pCAM35S-InsK的構建。將人工合成的人胰島素基因InsK連接到p11Z載體上并測序，然后從pBI221載體上切下CaMV?35S啟動子，置于胰島素基因的上游。將CaMV?35S-InsK切下后置于植物表達載體pCAMBIA1390的nos終止子之前，經酶切和PCR鑒定證明載體構建正確。

本項發明的要點之三是在人胰島素基因的C端加上了KDEL的內質網滯留序列。研究證明在蛋白質的C端加上KDEL的四個氨基酸序列，能夠使該蛋白質滯留于內質網中，從而避免被大量降解。

本項發明的要點之四是農桿菌介導的生菜轉化。將植物表達載體pCAM35S-InsK凍融法轉入農桿菌LBA4404。農桿菌在含鏈霉素的YEB培養基中繁殖后與生菜葉片共培養，共培養的葉片在含Cb和潮霉素的篩選培養基上放置一段時間后出現愈傷組織，然后愈傷組織分化長出小苗，將小苗分別移入不同瓶中，經PCR鑒定陽性植株，并進一步Southern?blotting和ELISA鑒定。

在本發明的一個實施方案中，關于人胰島素基因的合成，選用植物偏愛的密碼子。為此在人胰島素A鏈63個堿基中更換了13個堿基。在B鏈90個堿基中更換了18個堿基，另外在3’端加上了12個堿基編碼內質網滯留序列KDEL。在A鏈與B鏈之間我們設計了6個氨基酸的連接片段。此連接片段的氨基酸種類及順序的設計原則是保持人胰島素天然的三維結構特征。我們將人工合成的包含人胰島素A鏈與B鏈及中間小段連接順序克隆于pGEM-11Z載體中的EcoRI和BamHI位點，并經質粒酶切圖譜的分析及序列分析加以確定，該質粒命名為p11Z-InsK。在這一實施方案中，人胰島素基因片段可以通過PCR擴增得到，擴增時，使用的引物如下：InsK?5’：5’-GAT?CCA?TGT?TCG?TTA?ACC?AAC?ACC-3’InsK?3’：5’-CTC?GTC?CTT?GTT?GCA?GTA?GTT?CTC-3’。

在本發明的一個實施方案中，人胰島素基因置于組成型表達啟動子CaMV35S啟動子的調控之下，再轉入中間載體中。再進一步轉入雙元表達載體，完成一個植物表達載體的構建(見圖1、人工合成的人胰島素基因的克隆及植物表達載體的構建流程圖。其中人胰島素基因處于組成型啟動子CaMV35S的控制下)。

此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代號為p11Z-InsK，保藏編號為CGMCC?NO.0723，保藏日期為2002年3月8日。一、合成人胰島素基因InsK序列：1?????GATCCATGTT?CGTTAACCAA?CACCTTTGCG?GATCTCACCT?TGTTGAGGCT?CTTTACCTTG61????TTTGCGGAGA?GAGGGGATTC?TTCTACACCC?CAAAGACCGG?AGGACCATCT?GGAGGAGGAA121???TCGTTGAGCA?ATGCTGCACC?TCTATCTGCT?CTCTTTACCA?ACTTGAGAAC?TACTGCAACA181???AGGACGAGCT?TTAAG