[發明專利]天然離解素γ基因以及抗腫瘤活性多肽離解素γ

無效

• 申請號: 02103679.9
• 申請日: 2002-02-08
• 公開（公告）號: CN1374318A
• 公開（公告）日: 2002-10-16
• 發明（設計）人: 糜軍
• 申請（專利權）人: 糜軍
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07K14/435;C12N15/12;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京太兆天元專利代理有限責任公司
• 代理人: 張韜

技術領域

本發明涉及從中國五步蛇(尖吻腹)毒液中分離、純化得到的一種新的離解素-離解素γ，并克隆得到了其編碼基因。離解素γ作為一種活性多肽，在腫瘤治療的應用上具有廣闊前景。本發明屬于基因工程領域。

發明背景

目前，腫瘤患者死亡率仍居高不下。除極少部分腫瘤患者能在早期采用手術聯合放療或化療的治療效果尚可外，絕大部分腫瘤患者治療效果不佳，而且放療和化療都嚴重損害患者的身體健康。

惡性腫瘤細胞通過粘附血管和淋巴管周圍的胞外基質，侵蝕進入血液系統和淋巴系統，從而造成腫瘤細胞的轉移。而腫瘤細胞在體內的轉移是目前惡性腫瘤致死的主要原因。

大量研究表明，腫瘤細胞表面的融合素(Integrin)是腫瘤轉移發生的關鍵所在。融合素是由非共價連接的α和β亞基組成的異二聚體，連接了周圍的胞外基質蛋白與胞內細胞骨架蛋白actin等[Schoenwaelder?SM等，Curr?Opin?Cell?Biol，1999；11：274-286]。融合素不僅能與內皮細胞、成纖維細胞等基質細胞的胞外蛋白結合，導致細胞的粘附；同時，融合素，特別是α_Vβ₃亞家族，與基質蛋白的結合能夠激活并誘導腫瘤細胞表面特異性基質蛋白酶(如MMPS、ADAMs等)的表達[Iba?K等，Am?J?Pathol1999；154：1489-1501，McDonnell?S等，Clin?Exp?Metastasis?1999；17：341-349]，而這些特異性基質蛋白酶具有水解基質蛋白的作用，促使腫瘤細胞侵蝕進入血液系統和淋巴系統，導致腫瘤細胞的轉移；融合素還能與許多可溶性生長因子、分化因子結合，參與細胞內信號傳導，與Ras-、Rho-等GTPase家族直接相關，調節細胞凋亡、腫瘤新生血管生成[Kjoller?L，Exp?Cell?Res?1999；253：166-179，Giancotti?FG等，Science1999；285：1028-1032]。

離解素(Disintegrin)是一種可溶性短鏈多肽，富含半胱氨酸，含有融合素特異性識別保守序列Arg-Gly-Asp(RGD)，或Lys-Gly-Asp(KGD)，呈現特異性三維空間結構，能與融合素α_Vβ₃亞家族和α_Vβ₅亞家族高親和力結合[Dennis?MS等，Proc?Natl?Acad?Sci1990；87：2471-2475]，具有融合素拮抗劑作用，能減少細胞表面粘附分子的表達，并調節細胞內信號傳導，在腫瘤治療的應用上具有廣闊前景。

發明內容

本發明應用生物醫學工程的方法，為腫瘤，特別是實體瘤的治療提供了一種新的抗腫瘤藥。

本發明人從中國五步蛇(尖吻腹)毒液中分離、純化得到了一種新的離解素-離解素γ，并克隆得到了其編碼基因。離解素γ是一種活性多肽，包含具有SEQ?IDNO：1所示氨基酸序列或及其序列片斷或同源序列。離解素γ分子量為7.5KD，富含半胱氨酸，含有融合素特異性識別保守序列Arg-Gly-Asp(RGD)，呈現特異性三維空間結構，具有強力抑制血小板凝集的作用。

實驗結果表明，離解素γ不僅能抑制新生血管的形成，還明顯抑制實驗性腫瘤的轉移。

本發明技術方案描述如下：

一、天然離解素γ的分離與純化

本發明首先將五步蛇毒液用50mM?Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋20倍，裝入用相同緩沖液平衡過的Superdex?G75?2mm直徑層析柱，以5ml/min的流速，用含乙腈的0.1％(W/V)的三氟乙酸梯度洗脫，得到五步蛇(尖吻腹)蛇毒蛋白小分子量多肽組份，再將洗脫下來的蛋白組份用50mM?Tris-HCl緩沖液(pH7.5)稀釋10倍后，經DEAE-Sepharose陰離子交換層析柱，以1ml/min流速，用5M?NaCl溶液梯度洗脫得到離解素γ。

二、離解素γ編碼基因的克隆

本發明使用Trozil試劑(Gibco公司生產)與五步蛇毒腺組織混合(每克組織加1毫升Trozil)，勻漿后提取總RNA，以多聚寡核苷酸d(T)作為反義鏈引物(TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT，TTT)，逆轉錄得到五步蛇毒腺cDNA文庫，根據蛇毒ADAMs前體中離解素結構域與金屬蛋白酶結構域之間的高度保守核苷酸序列(SEQID?NO：2)作為正義鏈引物，經PCR克隆得到離解素γ編碼基因cDNA(SEQ?IDNO：3)。

基因克隆的過程為：