[發明專利]細胞保存液和使用該保存液的細胞保存方法

有效

• 申請號: 01804458.1
• 申請日: 2001-11-28
• 公開（公告）號: CN1396951A
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發明（設計）人: 馬場憲三;黑巖保幸;關根暉彬
• 申請（專利權）人: 胡曼泰克有限公司
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;//
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

技術領域

本發明涉及含有精制白蛋白和二甲基亞砜的用于保存細胞的保存液，以及使用上述保存液保存細胞以提高保存后復活的有效細胞率的方法。

背景技術

由于原始細胞的各種性質，因而用于保存細胞的保存液和方法是未解決的。例如，諸如微生物的細胞一般以這樣的方式保存：將微生物懸浮在含有大約10％甘油的微生物培養基中并在低溫下保存，或者凍干這些微生物。通過以下方法完成哺乳動物細胞的保存：將細胞懸浮在含有來自牛胚胎的血清和大約10％二甲基亞砜的培養基中，預先將含有細胞的培養基急速冷凍，然后在液氮貯庫中保存。

在生殖細胞如精子的保存中，將含共源白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水用作保存液。在哺乳動物細胞的保存中，一般使用含血清的保存液或不含血清的保存液。作為含血清的保存液，已知通過使培養基充滿血清和二甲基亞砜而制得的細胞保存液。同時，已知含有羧甲基纖維素而沒有血清的不含血清的保存液(特開平6-46840號)。

但是，不含血清的保存液的細胞保存性能差。因為普通的培養基含血清，因此在許多情況下使用含血清的保存液。由于保存哺乳動物細胞比保存微生物細胞或生殖細胞更難，因此使用用于哺乳動物細胞的保存液保存比哺乳動物細胞更容易保存的生殖細胞。

但是，用于含血清保存液的培養基隨要培養的細胞而變，而且，大量不同的血清也因此而與細胞一起使用。因此，難以將自己制備的細胞保存液用作保存其它細胞的液體。此外，含血清的保存液不僅含有細胞因子、生長因子、激素等等作為含血清成分，還含有具有保存細胞根本不需要的非必要成分的宿主的培養基，因而可能被改變性質，并存在受血清中可能含有的未知病毒的影響的問題。

也就是說，上述含血清的保存液存在導致保存期間細胞變性，未知病毒污染和由于保存液組成不確定而引起的難以穩定其品質的多種缺點。????

因此，本發明的目的是提供包含明確成分并具有極好的細胞保存性能的不含血清和培養基的細胞保存液，以及使用此細胞保存液的細胞保存方法。

發明內容

為了消除上述常規細胞保存液存在的各種缺陷，本發明提供包含精制白蛋白和二甲基亞砜的細胞保存液。所述精制白蛋白可以來自牛。除了精制白蛋白和二甲基亞砜以外，此保存液可以含有糖。糖可以是單糖。

而且，本發明的細胞保存液中的糖可以是葡萄糖。除了精制白蛋白和二甲基亞砜以外，還可以含有磷酸根離子。或者，除了精制白蛋白和二甲基亞砜以外，還含有金屬離子。

此外，本發明的細胞保存液中的金屬離子可以是二價金屬離子。

而且，本發明提供細胞保存方法，所述方法包括將細胞懸浮在上述細胞保存液中，將懸浮的細胞分配到多個保存容器中，并在不進行預冷凍的情況下將要保存的懸浮的細胞冷凍。在此細胞保存方法中，將分配到保存容器中的細胞懸浮使之具有1×10³-1×10⁸的濃度以深低溫保藏。

本文以下將描述本發明的其它目的和優點。

具體實施方式

上述含血清的細胞保存液存在導致保存期間細胞變性，未知病毒污染和由于保存液組成不確定而引起的難以穩定其品質的多種缺點。為了消除含血清的細胞保存液的這些問題，根據本發明，開發出成分明確并具有極好的細胞保存性能的不含血清和培養基的細胞保存液，以及使用此細胞保存液的細胞保存方法。使用本發明的細胞保存液，反復進行試驗。

在這些試驗中，通過以下方法制作本發明的不含血清且不含培養基的細胞保存液：配制含有迄今用作含血清保存液的添加劑的二甲基亞砜和通常用于保存生殖細胞的磷酸鹽緩沖鹽水中所含的白蛋白的主要試劑，將輔助試劑如磷酸根離子、二價金屬離子或單糖加入主要試劑中。試驗結果是，令人驚奇地發現，本發明的不含血清且不含培養基的細胞保存液表現出不僅能有效保存哺乳動物細胞，還能有效保存微生物細胞和生殖細胞的極好性能。因此，這種細胞保存液和使用這種細胞保存液的細胞保存方法可以通過本發明實現。

以下將對本發明進行更為具體的描述。本發明的細胞保存液的特征在于含有精制白蛋白和二甲基亞砜。作為本發明所用的二甲基亞砜，可以使用常用的市售產品。關于為了期望目的而應用的二甲亞砜的量，二甲基亞砜濃度低于0.1％(w/w)導致細胞保存能力降低。相反，如果濃度超過保存液總量的50％(w/w)，則作用不再改變。因此，從性價比的角度考慮，二甲基亞砜的濃度可以確定為0.1％-50％(w/w)，優選為1％-20％(w/w)。