[發(fā)明專利]耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶基因序列及編碼的多肽和制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01145569.1
• 申請日: 2001-12-27
• 公開（公告）號: CN1371998A
• 公開（公告）日: 2002-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 包其郁;楊煥明;張立敏;汪建;王光信
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州華大基因研發(fā)中心
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N15/63;C12N1/20;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 韓介梅

???????????????????????技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。

???????????????????????背景技術(shù)

GTP(三磷酸鳥苷)環(huán)式水解酶(GTP-CH-I；E.C.3.5.4.16)，催化GTP轉(zhuǎn)化成為二氫新蝶呤三磷酸鹽，是四氫生物蝶呤生物合成反映過程中的一個限速酶，它的活性對于由四氫生物蝶呤抑制的反饋蛋白具有敏感性。在哺乳動物體內(nèi)，二氫新蝶呤三磷酸鹽可以在6-丙酮四氫葉酸合成物以及墨蝶呤還原酶的一系列作用下，被轉(zhuǎn)化成為四氫生物蝶呤。

四氫生物蝶呤作為一種重要的協(xié)同因子，作用于氮氧化合成，丙三醇乙醚單氧酶，以及蝶呤需求性單氧酶。四氫生物蝶呤是酪氨酸羥化酶的協(xié)同因子，多巴胺生物合成的限速酶。在植物以及一種微生物中，這個蛋白酶產(chǎn)物作為第一媒介應(yīng)用于四氫葉酸的生物合成。四氫生物蝶呤的實用性顯示出對這些蛋白酶活性的限制，以及因此而影響集中關(guān)鍵信號分子產(chǎn)生的速度(例如，氮氧化合物，去甲腎上腺素，腎上腺素，以及包含于血液中的復(fù)合胺)。

四氫生物蝶呤在哺乳動物細(xì)胞中的水平主要決定于三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶的活性。三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶基因的突變與幾種疾病相關(guān)，包括多巴性肌張力阻礙以及非典型性苯丙酮尿酸癥。顯性遺傳的遺傳性肌張力障礙，也稱作多巴反應(yīng)性肌張力障礙，是由三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶基因突變，蛋白酶激活局部性疾病，以及低于正常20％的條紋型多巴胺水平引起的。哺乳動物體內(nèi)的三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶可以被四氫生物蝶呤所抑制，而且通過結(jié)合三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶的反饋調(diào)節(jié)蛋白的聯(lián)合體，能夠被苯基丙氨酸激活。四氫生物蝶呤的抑制作用可以被三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶反饋調(diào)節(jié)蛋白GFRP所調(diào)節(jié)，而且丙氨酸特異的四氫生物蝶呤依賴性抑制。

E.coli三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶I的結(jié)構(gòu)，老鼠肝臟6-丙酮四氫生物蝶呤合成酶，以及老鼠墨嘌呤還原酶已經(jīng)被x-射線所鑒定；三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶是一個環(huán)形的，D5-對稱性的十個類似物(homodecamer)。這十個等同的激活位點被定位在周邊，而且每個催化位點被定位在三個相鄰亞基的接觸面上。

雖然三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶的反應(yīng)機制在生物化學(xué)以及晶體學(xué)研究中已經(jīng)被提出，但是這個復(fù)雜反應(yīng)序列的細(xì)節(jié)仍然不得而知。在這個蛋白酶的活性位點處發(fā)現(xiàn)的一個重要的鋅離子，使我們清楚的鑒別這個反應(yīng)成為可能。

騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter?tangcongensis)，是生活在我國云南省騰沖縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細(xì)菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽性。它由中國科學(xué)院微生物所首先發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了分類學(xué)上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4^T(Chinese?collection?of?microorganisms?AS?1.2430^T＝JCM?11007^T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內(nèi)所具有的耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶也具有自己特有的結(jié)構(gòu)。

??????????????????????????發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶活性的多肽的核苷酸序列。

本發(fā)明的目的之二是提供一種分離的具有耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶活性多肽。

本發(fā)明的另一目的還提供了嗜熱厭氧菌的三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶重組載體、含有重組載體的宿主細(xì)胞，以及制備蛋白的方法。

本發(fā)明一方面提供一種能編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當(dāng)或與三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶相關(guān)。核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括：缺失、無義、插入、錯義。

本發(fā)明另一方面提供了一種耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶活性的多肽。該多肽具有SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本發(fā)明提供的制備耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶的方法包括如下步驟：

1)分離出編碼耐高溫三磷酸鳥苷環(huán)式水解酶的核苷酸序列SEQ?ID?NO.1；

2)構(gòu)建含SEQ?ID?NO.1核苷酸序列的表達(dá)載體；