[發明專利]耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因序列及編碼的多肽和制備方法

無效

• 申請號: 01145569.1
• 申請日: 2001-12-27
• 公開（公告）號: CN1371998A
• 公開（公告）日: 2002-10-02
• 發明（設計）人: 包其郁;楊煥明;張立敏;汪建;王光信
• 申請（專利權）人: 杭州華大基因研發中心
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N15/63;C12N1/20;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 韓介梅

???????????????????????技術領域

本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。

???????????????????????背景技術

GTP(三磷酸鳥苷)環式水解酶(GTP-CH-I；E.C.3.5.4.16)，催化GTP轉化成為二氫新蝶呤三磷酸鹽，是四氫生物蝶呤生物合成反映過程中的一個限速酶，它的活性對于由四氫生物蝶呤抑制的反饋蛋白具有敏感性。在哺乳動物體內，二氫新蝶呤三磷酸鹽可以在6-丙酮四氫葉酸合成物以及墨蝶呤還原酶的一系列作用下，被轉化成為四氫生物蝶呤。

四氫生物蝶呤作為一種重要的協同因子，作用于氮氧化合成，丙三醇乙醚單氧酶，以及蝶呤需求性單氧酶。四氫生物蝶呤是酪氨酸羥化酶的協同因子，多巴胺生物合成的限速酶。在植物以及一種微生物中，這個蛋白酶產物作為第一媒介應用于四氫葉酸的生物合成。四氫生物蝶呤的實用性顯示出對這些蛋白酶活性的限制，以及因此而影響集中關鍵信號分子產生的速度(例如，氮氧化合物，去甲腎上腺素，腎上腺素，以及包含于血液中的復合胺)。

四氫生物蝶呤在哺乳動物細胞中的水平主要決定于三磷酸鳥苷環式水解酶的活性。三磷酸鳥苷環式水解酶基因的突變與幾種疾病相關，包括多巴性肌張力阻礙以及非典型性苯丙酮尿酸癥。顯性遺傳的遺傳性肌張力障礙，也稱作多巴反應性肌張力障礙，是由三磷酸鳥苷環式水解酶基因突變，蛋白酶激活局部性疾病，以及低于正常20％的條紋型多巴胺水平引起的。哺乳動物體內的三磷酸鳥苷環式水解酶可以被四氫生物蝶呤所抑制，而且通過結合三磷酸鳥苷環式水解酶的反饋調節蛋白的聯合體，能夠被苯基丙氨酸激活。四氫生物蝶呤的抑制作用可以被三磷酸鳥苷環式水解酶反饋調節蛋白GFRP所調節，而且丙氨酸特異的四氫生物蝶呤依賴性抑制。

E.coli三磷酸鳥苷環式水解酶I的結構，老鼠肝臟6-丙酮四氫生物蝶呤合成酶，以及老鼠墨嘌呤還原酶已經被x-射線所鑒定；三磷酸鳥苷環式水解酶是一個環形的，D5-對稱性的十個類似物(homodecamer)。這十個等同的激活位點被定位在周邊，而且每個催化位點被定位在三個相鄰亞基的接觸面上。

雖然三磷酸鳥苷環式水解酶的反應機制在生物化學以及晶體學研究中已經被提出，但是這個復雜反應序列的細節仍然不得而知。在這個蛋白酶的活性位點處發現的一個重要的鋅離子，使我們清楚的鑒別這個反應成為可能。

騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter?tangcongensis)，是生活在我國云南省騰沖縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它由中國科學院微生物所首先發現并進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4^T(Chinese?collection?of?microorganisms?AS?1.2430^T＝JCM?11007^T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶也具有自己特有的結構。

??????????????????????????發明內容

本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的核苷酸序列。

本發明的目的之二是提供一種分離的具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性多肽。

本發明的另一目的還提供了嗜熱厭氧菌的三磷酸鳥苷環式水解酶重組載體、含有重組載體的宿主細胞，以及制備蛋白的方法。

本發明一方面提供一種能編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與三磷酸鳥苷環式水解酶相關。核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括：缺失、無義、插入、錯義。

本發明另一方面提供了一種耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽。該多肽具有SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本發明提供的制備耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的方法包括如下步驟：

1)分離出編碼耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的核苷酸序列SEQ?ID?NO.1；

2)構建含SEQ?ID?NO.1核苷酸序列的表達載體；