[發明專利]一種重組人肝細胞生長因子的制備方法

無效

• 申請號: 01140204.0
• 申請日: 2001-12-05
• 公開（公告）號: CN1385533A
• 公開（公告）日: 2002-12-18
• 發明（設計）人: 牛勃;向前;解軍;常冰梅;楊濤;楊琦;張悅紅
• 申請（專利權）人: 協和生物工程研究所有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/70;C12N15/12;C07K14/475;C07K19/00;C12P21/02
• 代理公司: 北京科龍環宇專利事務所
• 代理人: 楊厚,孫皓晨

1、一種重組人肝細胞生長因子(rhHGF)的制備方法，其特征在于所述方法是將基因工程技術與蛋白質工程技術相結合，對HGF基因進行轉錄前加工、修飾，分別構建HGF重鏈(α鏈)表達體系和HGF輕鏈(β鏈)表達體系，分別表達HGF的重鏈蛋白和輕鏈蛋白，然后利用異源蛋白體外共復性技術，制備有野生活性的HGF蛋白。

2、按照權利要求1所述的制備方法，其特征是hHGFα原核表達體系的構建采取以下步驟：

A)根據真核基因在原核細胞中表達的要求和hHGF基因序列分析結果，設計合成一對引物，以HGF為模板，通過聚合酶鏈反應(PCR)，擴增得到相應序列并加上起始密碼ATG、串聯終止密碼TAA、TGA及適于克隆和表達的酶切位點的hHGFαcDNA；

B)將hHGFαcDNA基因片段經合適的酶切重組到原核表達克隆載體上，構建得到含hHGFα的重組質粒。

3、按照權利要求1所述的制備方法，其特征是hHGFβ基因表達體系的構建采取以下步驟：

A)根據真核基因在原核細胞中表達的要求和hHGFβ基因序列分析結果，設計合成一對引物，以HGF為模板，經過PCR后，擴增得到含有翻譯起始密碼的ATG和SD序列及SD間隔，加上相應酶切位點的hHGFβcDNA；

B)利用相應的酶切位點將hHGFβcDNA定向克隆到原核表達載體上，經過篩選、限制性內切酶切，構建得到含hHGFβ的重組質粒。

4、按照權利要求1或2所述的制備方法，其特征是hHGFα蛋白質的表達和分離純化步驟如下：

A)將構建的含hHGFα重鏈表達質粒用氯化鈣等轉化法轉化至大腸桿菌中，經選用最適細菌生長和蛋白表達的發酵培養基培養，經誘導表達的方法，表達人肝細胞生長因子重鏈蛋白hHGFα，SDS-PAGE分析表達產物；

B)以包涵體形式存在于大腸桿菌中的表達菌體按一定比例重懸于Tris緩沖液中，加溶菌酶消化，超聲破菌，加脫氧膽酸納，離心取沉淀，將其重懸于尿素緩沖液中，離心棄上清，用含尿素的緩沖液II洗滌沉淀，將沉淀溶于含尿素的緩沖液，離心回收包涵體溶解液上清，用凝膠過濾層析進一步純化，分部收集洗脫峰，SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在峰。

5、按照權利要求1或3所述的制備方法，其特征是hHGFβ蛋白質的表達和分離純化步驟如下：

A)將構建的含hHGFβ轉化到大腸桿菌中，經選用最適細菌生長和蛋白表達的發酵培養基培養，用誘導表達的方法，表達人肝細胞生長因子輕鏈蛋白hHGFβ，SDS-PAGE分析表達產物；

B)以包涵體形式存在于大腸桿菌中的hHGFβ蛋白質的分離純化步驟如下：

離心收集誘導表達的菌體，加入緩沖液，攪拌，使菌體分散均勻；加蛋白酶抑制劑、溶菌酶，攪拌，加脫氧膽酸納；超聲破菌，低溫高速離心，沉淀中加入Tris溶液，攪拌，低溫離心，沉淀重懸于尿素緩沖液；包涵體按濃度比加入含尿素的變性液中室溫作用，離心沉淀，包涵體溶解液經凝膠過濾層析純化目的蛋白，將純度較高的收集液合并，用于復性。

6、按照權利要求1、4或5所述的制備方法，其特征是hHGFα與hHGFβ蛋白的體外共復性是采用梯度稀釋的方法，將目的峰中蛋白質調至規定濃度，然后調整hHGF-α與hHGF-β蛋白的摩爾比，間隙使用含還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)的復性液，降低尿素的濃度，在透析液中充分透析，將透析后的共復性樣品經離子交換層析純化，最終得到有野生活性的HGF。