[發明專利]重組恥垢分支桿菌其制備及在治療膀胱腫瘤藥物中的應用

無效

• 申請號: 01128927.9
• 申請日: 2001-09-28
• 公開（公告）號: CN1339583A
• 公開（公告）日: 2002-03-13
• 發明（設計）人: 靳鳳爍;姚建忠
• 申請（專利權）人: 靳鳳爍;姚建忠
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;A61K35/74;A61P35/00;A61P13/10
• 代理公司: 重慶市專利事務所
• 代理人: 劉小紅

1、一種重組恥垢分支桿菌，其特征是：a.由恥垢分枝桿菌和由分枝桿菌表達質粒，人結核桿菌熱休克蛋白70啟動子cDNA，堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽cDNA及人白細胞介素-2cDNA組成的分枝桿菌穿梭表達載體構成；b.經基因工程重組后的恥垢分支桿菌，其特性不變，同時在含有卡那霉素抗性的Lemco?broth培養基中可以穩定。即為本重組菌生長傳代，表現為黃白色菌落，通過蛋白印跡分析法和ELLSA免疫分析法檢測到其中的IL-2蛋白表達。

2、一種制備重組恥垢分支桿菌的方法，其特征在于：

第一步，將含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因的重組質粒pIJK-1，根據其全長序列，設計一對引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點，從中擴增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽基因，將含有人結核分枝桿菌hsp70的啟動子和編碼基因重組質粒pY6013，經NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號肽基因構建4.5kb的重組質粒pY-α；

第二步，重組質粒pHIG53含有人白細胞介素-2編碼基因，PCR擴增不含信號肽的人白細胞介素-2編碼基因片斷；重組質粒pY-α用相應的限制性內切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的基因片段和載體進行連接和轉化，構建成中間克隆載體pY-α-IL-2；

第三步，將分枝桿菌質粒pRR3用限制性內切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質粒pY-α-IL-2用限制性內切酶EcoRI消化，與載體pRR3進行連接和轉化，構建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達載體pR-α-IL-2；

第四步，利用電穿孔轉化法將穿梭表達載體pR-α-IL-2轉入恥垢分枝桿菌M.smegmatis?mc²?155中，構建了表達人IL-2的分枝桿菌菌株，即重組恥垢分枝桿菌。

3、重組恥垢分枝桿菌在用于制備膀胱腫瘤藥物上的應用。