[發明專利]人DNA聚合酶β突變基因和對應蛋白

無效

• 申請號: 01128374.2
• 申請日: 2001-08-24
• 公開（公告）號: CN1366047A
• 公開（公告）日: 2002-08-28
• 發明（設計）人: 董子明;趙國強;趙勤;譚曉輝;楊洪艷;薛樂勛
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/12;C12N15/52;C07K14/435
• 代理公司: 鄭州科維專利代理有限公司
• 代理人: 劉衛東

????????????????????技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種新的人基因核苷酸序列，具體涉及一種人類修復基因DNA聚合酶β的cDNA序列，是DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表現形式，稱為M-POLB，它所編碼的蛋白完全喪失DNA聚合酶β的DNA修復活性，該蛋白稱為M-POLB.AMI。即本發明涉及了該基因的cDNA編碼序列、該核苷酸序列編碼的多肽以及利用重組技術生產所述的新的M-POLB.AMI的方法。

????????????????????背景技術

1971年Weissbach等從牛胸腺中分離出了一類不同于DNA聚合酶α的新的DNA聚合酶，并命名為DNA聚合酶β(Polymeraseβ，POLB)，其全稱為依賴DNA的DNA聚合酶β。迄今為止它是真核生物中已知的五種DNA聚合酶之一。有人稱其為生物進化過程中的“看家酶”^[1]。POLB是一種分子量為39kDa的小分子多肽，廣泛存在于哺乳類動物細胞內，其功能主要是參與DNA的損傷修復(Dresler?Sl?et?al，J?Rio?Chem，1983：258：9990-9994)。POLB分子結構和催化活性：POLB是廣泛存于哺乳動物細胞核內，是一條由單條肽鏈小分子蛋白質，其分子量為39Kda，在溶液中以單鏈形式存在。人和嚙齒類動物POLB的一級結構為一條由335個氨基酸組成的多肽，其2級結構中有10％的螺旋和50％?β片層(TanabeK?et?al，J?Bio?Chem，1981，256：3089-3102)。由四個亞基構成。POLB具有催化DNA聚合的作用，但它與其它DNA聚合酶不同，不具有3’→或5’→核酸外切酶活性，亦無焦磷酸置換，焦磷酸水解，dNTP和RNA水解功能。用蛋白裂解法證明該酶有兩個不同的功能區(Beard?Wa?et?al.Mutat?Res?2000，30；460：231-44)：一個N-未端，約含有75個氨基酸；一個C-末端，約含有250個氨基酸，。在催化DNA聚合反應時，前者與模板結合，后者與dNTP結合。進一步研究表明，C-末端區分為三個亞區：一個“指部”亞區(88至151氨基酸)；一個“掌部”亞區(151至262氨基酸)和一個“拇指”亞區(263至355氨基酸)。N-末端具有切除脫氧磷酸殘基的活性并與DNA模板及引物具有高度的親和性；它的催化中心位于Lys72。而C-末端區具有核苷酸轉移活性即聚合酶活性其中最重要的催化位點，位于掌亞區的190位和192位氨基酸的Asp以及拇指區256位氨基酸的Asp和283的Arg，它們均與核苷酸轉移活性關系密切(M.R，Sawaya，et?al，Science?1994，264：1930-1935)。更深入的研究表明：拇指亞區的運動對POLB的活性非常重要，在缺乏DNA和dNTP的情況下，位于鹽橋中的Asp192與Arg258結合；而DNA和dNTP存在的情況下，拇指亞區與掌亞區接近，拇指亞區殘基Glu295和Tys296以氫鍵結合到Arg258上，接著，Arg192從Arg258上解脫而連接上一個Mg²⁺，作為連接金屬離子的核苷酸來激活核苷酸轉移步驟。在催化反應過程中，需要Mg²⁺或Mn²⁺作為激活劑。與引物適當的結合形狀、原料dNTP及POLB活性位點氨基酸殘基均是該酶保真性的影響因素。其反應過程遵循BiBi機制：即它先和模板引物結合，再與dNTP反應，在雙鏈DNA缺口中插入一個核苷酸時，再次與引物的3’-OH結合，開始第二輪反應。反應的最適PH在8.5-9.0范圍內，高鹽濃度(＞100mmol/L)對酶有激活作用，甘油和蔗糖對其也有激活作用。pH在4.5-10.5范圍內該酶較穩定，若在酶溶液中加入蛋白質可以增加它的穩定性。它對許多試劑有抗性，如5M脲、磷酸乙酯、20％-50％Z醇和丙酮均可影響其活動。但是該酶的穩定性較差，在過熱(＞42℃)時此酶更容易失去活性。某些抑制劑(如d₂TTP和d₂CTP)能特異性地抑制POLB的活性。綜觀現有研究結果，POLB參于DNA的聚合反應特點是：催化雙鏈DNA上短小缺口中的DNA合成，當這些缺口在10個核苷酸下時它能將它們完成填補，對DNA雙鏈上更大的缺口的修補，常常需要與其它修復酶共同參于。POLB還可能參與DNA的重組合成以及由單鏈DNA向雙鏈DNA轉化的過程。