[發明專利]一種新型DNA腫瘤疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 01126890.5
• 申請日: 2001-09-27
• 公開（公告）號: CN1380107A
• 公開（公告）日: 2002-11-20
• 發明（設計）人: 何球藻;王纓;張躍建;秦慧蓮;熊思東
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬生物工程領域，具體涉及一種新型DNA腫瘤疫苗及其制備方法

技術背景

HER2/neu原癌基因，也稱c-erbB2基因，是人類腫瘤中最常見發生變化的癌基因之一，主要表達在胚胎組織及某些腫瘤細胞中，如在乳腺癌，卵巢癌，胃腸道腫瘤，膀胱癌，非小細胞肺癌，腎癌中均存在HER2/neu原癌基因不同程度的過度表達或基因擴增，因此，HER2/neu原癌基因及其產物P185蛋白作為腫瘤治療的靶抗原是近年來的研究熱點。有研究表明，在某些腫瘤患者體內存在著針對HER2/neu的抗體及CTL反應，提示HER2/neu具有一定的免疫原性，可經過適當的免疫途徑誘導機體產生針對HER2/neu的免疫應答，進而制備腫瘤疫苗。然而在大部分HER2/neu陽性的腫瘤病人中，未能檢測出相應的免疫應答，表明對自體HER2/neu存在一定程度的免疫耐受。因此，要制作強免疫原性的腫瘤疫苗，必須對HER2/neu進行改造以超越機體對HER2/neu的免疫耐受，進而誘導特異性免疫應答，達到腫瘤防治的目的。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型DNA腫瘤疫苗，可誘導機體產生針對HER2/neu陽性的腫瘤細胞的細胞免疫和體液免疫，產生良好的抗腫瘤效應。本發明的另一目的是提供HER2/neu基因特定片斷的克隆方法和DNA腫瘤疫苗的制備方法。本發明的技術方案是通過下述步驟實現的：一克隆HER2/neu基因特定片斷，構建表達載體

從HER2/neu高表達的細胞株SKBR3克隆出人ER2/neu特定片斷基因。本發明采用RT-PCR法克隆人HER-2/neu的特定片斷，利用NotI/XhoI雙酶切定向插入到pcDNA3(商售)質粒中，構建人HER-2/neu基因真核表達載體pcDNA3-hSIDD。經測序證實獲取了HER2/neu特定基因片斷，表1是人pcDNA3-hSIDD的插入序列cDNA。用類似的方法同時得到大鼠HER2/neu基因特定片斷的表達載體pcDNA3-rSIDD。

將HER2/neu基因特定片斷的表達載體轉染多種細胞系，用ELISA和流式細胞儀(FACS)檢測發現該基因體外表達良好。將pcDNA3-rSIDD?DNA注射在小鼠肌肉，經免疫組化染色證實注射部位的肌肉組織有HER2/neu的有效表達。二檢測HER2/neu特定基因片斷的免疫原性

完整的HER2/neu作為胚胎組織和腫瘤表達的“自身”抗原，機體對其有一定的免疫耐受性。上述特定基因片斷并非天然的HER2/neu完整蛋白，但其中含有多個抗原表位，通過適當的免疫方案可以誘導機體產生相應的免疫應答。

本發明將pcNDA3-rSIDD免疫小鼠，用ELISA方法檢測到抗HER2/neu抗體，且可持續數天時間，證明rSIDD可以引起體液免疫應答；用特異性殺傷實驗證明pcDNA3-rSIDD?DNA免疫的小鼠脾細胞對表達PCDNA3-rSIDD轉染的腫瘤靶細胞有殺傷作用，若對該脾細胞在體外進行加強刺激，其對靶細胞的殺傷作用則明顯加強，同時脾細胞表型出現明顯變化，表現在T細胞明顯加強，主要是CD₈⁺T細胞明顯加強，而CD₄⁺T細胞比例無明顯變化。說明rSIDD?DNA免疫小鼠，可以誘導小鼠產生體液和細胞免疫應答。

同樣，通過DNA免疫技術，將人hSIDD?DNA免疫小鼠，也可以誘導出相應的抗體和細胞免疫應答。經過腫瘤細胞的再刺激后，hSIDD?DNA免疫小鼠脾細胞對人pcDNA3-hSIDD轉染的腫瘤靶細胞表現出特異細胞毒作用，脾細胞中CD₈⁺T細胞的增加可能與此有關。說明hSIDD免疫小鼠，也可以誘導小鼠產生體液和細胞免疫應答。

另外，本發明證明了這種免疫應答與HER2/neu蛋白的種屬差異無關，而且能誘導針對外來抗原的免疫應答。通過交叉反應，即將人hSIDD?DNA免疫小鼠，以大鼠rSIDD轉染的腫瘤細胞作為靶細胞進行細胞毒試驗，結果出現針對誘導抗原的免疫應答。

三、制備新型DNA腫瘤疫苗