[發明專利]用于特異性核酸檢測和定量的同組異序引物延伸方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 01121115.6
• 申請日: 2001-06-08
• 公開（公告）號: CN1333465A
• 公開（公告）日: 2002-01-30
• 發明（設計）人: 王小兵
• 申請（專利權）人: 王小兵;森澤紳勝
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N23/22;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 徐迅

1.一種檢測或定量樣品中靶核酸的方法，其特征在于，包括：

(a)制備一種或多種引物，該引物特異性配對于靶核酸的預定位置；

(b)在高度嚴謹的條件下，將(a)中的一種或多種引物與靶核酸退火，在靶核酸預定位置上得到引物-核酸雙鏈體；

(c)使(b)的引物-核酸雙鏈體與以下混合物混合，該混合物包括：

????(1)一種或兩種或三種類型的游離的非終止子核苷酸和至少一種類型的的任選地標記有可檢測的標記物的非終止子核苷酸，和

????(2)有或無一種類型與(1)的一種或兩種或三種類型非終止子核苷酸不同的終止子核苷酸；

(d)在合適的緩沖液中用酶或化學反應進行引物延伸反應；和

(e)檢測或定量引物延伸的核苷酸中標記信號的量，或

(f)用質譜檢測或定量延伸的引物的量。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物是核酸引物、寡脫氧核苷酸、寡核糖核苷酸、或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感興趣的核酸是脫氧核糖核酸、核糖核酸、或脫氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非終止子核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的終止子是雙脫氧核糖核苷酸。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非終止子和終止子核苷酸混合液的組合是：

(a)dATP、dCTP、dGTP、ddTTP或ddUTP，

(b)dATP、dCTP、dTTP或dUTP、ddGTP，

(c)dATP、dGTP、dTTP或dUTP、ddCTP，

(d)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP、ddATP，

(e)dATP、dCTP、dGTP

(f)dATP、dCTP、dTTP或dUTP，

(g)dATP、dGTP、dTTP或dUTP或

(h)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的至少一種非終止子核苷酸標記有可檢測的標記物。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的終止子核苷酸標記有或未標記與非終止子核苷酸的標記物不同的可檢測標記物。

9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標記物包括酶或蛋白質部分、放射性同位素、熒光部分或化學基團。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非終止子和終止子核苷酸是不帶標記物的，通過質譜分析延伸的引物量進行檢測或定量步驟。

11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶是模板依賴性的。

12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的模板依賴性酶是DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶。

13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的模板依賴性酶是大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4?DNA聚合酶、T7?DNA聚合酶、噬熱菌DNA聚合酶、逆轉錄病毒逆轉錄酶、或它們的組合。

14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是在體內、體外酶促合成的或非酶促合成的。

15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸是由聚合酶鏈式反應合成的。

16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸含有非天然核苷酸類似物。

17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述的非天然核苷酸類似物包括脫氧肌苷或7-脫氮-2’-脫氧鳥苷。

18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸包括生物體的基因組DNA、它的RNA轉錄物、或由生物體RNA轉錄物制備的cDNA。

19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述的生物體是植物、微生物、細菌、病毒。