[發(fā)明專利]棒狀細(xì)菌的精氨酸阻遏物缺陷型菌株和制備L－精氨酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01119656.4
• 申請日: 2001-04-28
• 公開（公告）號: CN1347982A
• 公開（公告）日: 2002-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 菅美喜子;朝倉陽子;森由起子;伊藤久生;倉橋修
• 申請（專利權(quán)）人: 味之素株式會社
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/10;//;C12R115)
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 張廣育,邰紅

本發(fā)明涉及一種能制備L-精氨酸的棒狀細(xì)菌以及利用該細(xì)菌制備L-精氨酸的方法。L-精氨酸是一種工業(yè)上有用的氨基酸，其作為肝功能促進(jìn)劑、氨基酸輸注劑、廣泛的氨基酸藥物等的成分。

常規(guī)的經(jīng)發(fā)酵制備的L-精氨酸是利用下列棒狀細(xì)菌得到的：棒狀細(xì)菌的野生型菌株；對某些試劑(包括磺胺類藥、2-噻唑丙氨酸、a-氨基-a-羥基戊酸等)有抗性的棒狀細(xì)菌；除了對2-噻唑丙氨酸有抗性，而且對L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表現(xiàn)為營養(yǎng)缺陷型的棒狀細(xì)菌(日本專利待審公開54-44096)；對酮丙二酸、氟代丙二酸或一氟乙酸具有抗性的棒狀細(xì)菌(日本專利待審公開57-18989)；對精氨醇(argininol)具有抗性的棒狀細(xì)菌(日本專利待審公開62-24075)；對X-胍具有抗性的棒狀細(xì)菌(X表示脂肪酸的衍生物或脂族鏈，日本專利待審公開2-186995)等等。

另一方面，現(xiàn)有技術(shù)還公開了利用重組DNA技術(shù)制備L-精氨酸的方法。即公開了利用棒桿菌或短桿菌屬的微生物制備L-精氨酸的方法，其中使得所述細(xì)菌攜帶有包括載體DNA和含有以下基因的DNA片段的重組DNA，所述基因為：來自屬于埃希氏菌屬微生物的乙酰鳥氨酸去乙酰基酶、N-乙酰谷氨酸-a-半醛脫氫酶、N-乙酰谷氨激酶(glutamokinase)和精氨琥珀酸酶(日本專利公開5-23750)。

另外，至于棒狀細(xì)菌，已經(jīng)知道L-精氨酸生物合成體系的某些酶的合成受到L-精氨酸的抑制。而且，據(jù)報道，在L-精氨酸生物合成體系的某些酶受到L-精氨酸抑制的同時，在棒狀細(xì)菌的突變株中取消了L-精氨酸對這些酶的抑制，而顯示出L-精氨酸積累量的增加(Agric.Biol.Chem.，43(1)，105，1979)。

同時，對于大腸桿菌，L-精氨酸生物合成體系的阻遏物和編碼該阻遏物的基因被鑒定(美國科學(xué)院學(xué)報(1987)，84(19)，6697-701)，還研究了該阻遏物蛋白質(zhì)的結(jié)合相互作用和L-精氨酸生物合成體系的各種基因(美國科學(xué)院學(xué)報(1987)，84(19)，6697-701，分子生物學(xué)雜志(1992)，226，367-386)。

但是，在棒狀細(xì)菌中還沒有確定L-精氨酸生物合成體系的任何阻遏物蛋白質(zhì)。盡管在該阻遏物蛋白質(zhì)基因(argR)的核苷酸序列和推測由其編碼的氨基酸序列登記在基因數(shù)據(jù)庫GnBank(AF049897)中，但該基因被命名為argR是因為在上述氨基酸序列和已知的精氨酸阻遏物之間有同源性。

如上所述，盡管研究了棒狀細(xì)菌的L-精氨酸生物合成體系的阻遏物蛋白質(zhì)及其基因，但是該阻遏物蛋白質(zhì)本身還未被確定，而且其功能等也根本沒有闡述。因此，本發(fā)明的一個目的是確定棒狀細(xì)菌中的L-精氨酸生物合成的阻遏物，提高棒狀細(xì)菌的L-精氨酸的生產(chǎn)率。

本發(fā)明的發(fā)明人從棒狀細(xì)菌中分離出在基因數(shù)據(jù)庫中以argR登記的基因(Genbank登記號為AF049897)的同系物，并且發(fā)現(xiàn)如果該基因在棒狀細(xì)菌中被擴(kuò)增，L-精氨酸的生產(chǎn)能力將下降，另一方面，如果破裂了該基因，L-精氨酸的生產(chǎn)能力將增加，由此證實了L-精氨酸生物合成受到棒狀細(xì)菌(如大腸桿菌)中的阻遏物和上述編碼該阻遏物以argR登記的基因的抑制。因此，本發(fā)明得以完成。

本發(fā)明提供了以下的內(nèi)容：

(1)一種棒狀細(xì)菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式發(fā)揮作用，并且其具有L-精氨酸生產(chǎn)能力。

(2)如(1)所述的棒狀細(xì)菌，其中由于該細(xì)菌染色體上編碼精氨酸阻遏物的基因的破裂，精氨酸阻遏物不以通常的方式發(fā)揮作用。

(3)如(2)所述的棒狀細(xì)菌，其中精氨酸阻遏物具有在SEQ?ID?NO：18中所示的氨基酸序列或者表現(xiàn)出與該氨基酸序列同源的氨基酸序列。

(4)一種制備L-精氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如(1)至(3)中任一項所述的棒狀細(xì)菌，以在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-精氨酸，并且從該培養(yǎng)基中收集L-精氨酸。

在本發(fā)明中，“精氨酸阻遏物”指的是一種具有抑制L-精氨酸生物合成作用的蛋白質(zhì)，如果編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量在棒狀細(xì)菌中增加，L-精氨酸的生產(chǎn)能力將下降，如果該表達(dá)量下降或該蛋白質(zhì)消失，那么L-精氨酸生產(chǎn)能力將增加。此后，編碼該精氨酸阻遏物的基因也被稱為argR基因。另外，用于本發(fā)明的“L-精氨酸生產(chǎn)能力”指的是，當(dāng)本發(fā)明的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其在該培養(yǎng)基中積累L-精氨酸的能力。

根據(jù)本發(fā)明，具有L-精氨酸生產(chǎn)能力的棒狀細(xì)菌的L-精氨酸的生產(chǎn)能力得到提高。

圖1表示質(zhì)粒pK1的構(gòu)建過程。

圖2表示質(zhì)料pSFLK6的構(gòu)建過程。