[發明專利]生長變更劑對微生物菌落影響的確定方法

無效

• 申請號: 01117809.4
• 申請日: 2001-02-16
• 公開（公告）號: CN1321773A
• 公開（公告）日: 2001-11-14
• 發明（設計）人: 斯蒂芬·C·沃德羅;羅伯特·A·利費恩
• 申請（專利權）人: 沃德羅合伙公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 黃革生

一般地，本發明涉及生長變更劑對生物樣品中的一種或多種微生物影響的確定方法，具體地說，涉及生長變更劑對生物樣品中的獨立的微生物菌落影響的確定方法。

對病人有效的治療經常需要對生物樣品中的微生物進行鑒別，和確定這些微生物對生長變更劑的敏感度。歷來，人們制備生物樣品并將其應用于或添加到微生物生長培養基(稱為“培養物”)中，接著主要進行基于肉眼的檢查和測試。在大多數常規測試中，用病人的樣品接種合適的生長培養基，且接著培養，直至出現可見的微生物生長跡象。大多數生物需要至少18至24小時的培養期，用以形成可見的菌落。獨立的菌落開始為單個或一小簇用顯微鏡可見的細胞或活的單位(總稱為菌落形成單位或CFU)，它們被包含于接種物中。在最初的遲滯期之后，有活力的微生物以指數增長：在一代中一個細胞增長成兩個細胞，在三代中增長到八個細胞，在六代中增長到64個細胞，直至產生肉眼可見的菌落，所述的遲滯期是指生物體由于其自身適應新環境和新的歷程幾乎不生長或沒有生長的時期。

如果接種物包含許多不同的微生物，每種微生物將形成其特有的菌落，能夠或不能夠從彼此之間被辨別出來。然而對于大多數目的，在生物體生長中只有單獨一種微生物存在是理想的。例如，某人想要測試一種生物樣品對具體的抗生素的敏感度，若該樣品和隨后的培養物含多種生物種類，他就不能確定在培養物中單個的生物體種類對抗生素的敏感度。為了確定單個生物體種類的敏感度，需要制備“純”培養物(即含一種單獨種類微生物的培養物)，它是通過在第一固體生長培養基上培養初始的樣品接種物，并從第一生長培養基取單個菌落、或一組同樣的菌落，并將其接種于第二固體生長培養基或在使用液體培養基的情況下形成懸浮液而制備的。本領域普通技術人員公認該方法花費時間，且一般需要熟練技術人員。

在需要知道生長變更劑(例如抗生素、生長促進劑、營養素、防腐劑等)對生物體的效力的情況下，現有技術一般的慣例是使用一種下述之一的評估方法。在一種方法中，生長變劑在培養之前，被施用于固體接種生長培養基區，且在施用區生物體的生長被評估，或與沒有施用生長變更劑的區域生物體的生長比較。Kirby-Bauer平板測試是這種目測方法的一個實例。Kirby-Bauer方法包括培養生長培養基直至在整個生長培養基上形成連片生長。含有從一圓盤擴散出來的有效的生長變更劑(抗菌劑)的生長培養基區域，如果抗菌劑在清除生物方面是有效的話，不會含有生物體的生長。圍繞該圓盤的無生長區域的大小接著與參照進行比較，以確定生物體對臨床中有效濃度的生長變更劑是否敏感。第二種評估方法包括向接種了待測生物的液體培養基中添加已知量的生長變更劑。渾濁度測試是這種類型目測方法的一個實例。渾濁度測試測量液體樣品的濁度，以確定樣品的生物體含量。樣品濁度的增長表明樣品中生物體含量的增長。第三種評估方法包括觀察生物體生長對染色試劑的效果，其中染色試劑對一種或多種生長生物體的成分或代謝產物產生反應。這些目測評估方法任意得到的信息一般說，性質上也是宏觀的；例如，以具體濃度施用的生長變更劑或者影響生物體的生長，或者不影響生物體的生長。關于例如死亡機理、生物是否有橫隔形成、或培養物中生物群體的任何統計信息，卻只能提供很少或不能提供更多信息。

上述目測方法的一個問題是由于等待直至生物體的可見層或可接受的生物體濃度的出現而產生的測試錯誤。生物體菌落在生長培養基上或其內部生長要競爭食物，結果由于競爭而不是由于生長變更劑導致生長被抑制。那些同樣的生物體也會由于其排泄物和代謝副產物而彼此影響。如果沒有這樣的干擾發生，則可能更準確地分析生長變更劑對特定微生物的影響。

用生物體目測評估的另一個問題是要產生有意義的結果需要時間。如上所述，一般需要將生物體培養物培養大致18至24小時，用以產生出生長充分的生物體以便目測評估(例如，如果生物體每20至60分鐘復制一次，就需要至少產生20代生物體)。然而實際地說，產生培養物并用常規方法分析它，由于操作、評估等至少需要花費48小時。因為，微生物生長的速率是如此之快，且測試時間是如此之長，所以被懷疑有微生物感染的病人，在確切微生物和其敏感度被鑒別之前，最初經常用廣譜抗生素治療。在接受測試數據之后，才進行更有針對性的治療。然而，本領域普通技術人員認識到，提供更迅速治療的廣譜抗生素相對于掌握具體信息的更有針對性的治療不是優選的。實際上，相對于更有針對性的藥物，廣譜抗生素可能昂貴得多并更具有負作用。如今也是相當令人擔憂的就是廣譜抗生素的過度使用，可能促進了生物體抗生素抗性的發展，因此限制了其藥效。