[發明專利]棉鈴蟲增效蛋白基因工程菌株的構建及其增效蛋白的表達

無效

• 申請號: 01114675.3
• 申請日: 2001-05-09
• 公開（公告）號: CN1384189A
• 公開（公告）日: 2002-12-11
• 發明（設計）人: 孟小林;徐進平
• 申請（專利權）人: 深圳萬德?；蚬こ逃邢薰?/a>
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/34;C12N15/70;C07K14/01;//;C12R119)
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本發明涉及在大腸桿菌中表達棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)增效蛋白，含有HaGV增效蛋白的基因的表達載體，在大腸桿菌中表達HaGV增效蛋白的方法。

目前，已在9種顆粒體病毒、舞毒蛾(Lymantria?dispar)NPV和4種痘病毒中發現了昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)^[1.2]。昆蟲病毒增效蛋白是病毒基因編碼的一種金屬蛋白酶，分子量為89-10KD，具有一個典型的金屬蛋白酶鋅-結合域HEXXH，位置十分保守，且對中腸圍食膜的降解作用受到金屬螯合劑的抑制。^[3.4]

昆蟲病毒增效蛋白可以提高昆蟲的敏感性，加速核型多角體病毒NPV的感染進程，^[5]同時能提高蘇云金桿菌伴孢晶體對幼蟲的毒力。^[6]增效蛋白的作用機制有二種：一種是增效蛋白能與中腸細胞膜上的特異位點結合，介導病毒囊膜與細胞質膜之間的融合，促進桿狀病毒進入宿主細胞內，從而增加病毒感染的效果。^[7-9]但增效蛋白與中腸細胞膜上的特異位點結合并不是增進病毒感染所必需的。^[10，11]另一種機制是增效蛋白通過降解腸粘蛋白IIM而破壞昆蟲幼蟲中腸圍食膜，使病毒粒子更容易進入中腸細胞，同時提高了某些必須穿透圍食膜而發生作用的生物殺蟲劑的效能。

目前，昆蟲病毒增效蛋白實施的基因工程主要有三種方式：1.將增效蛋白基因重組在AcMNPV等廣譜高效的病毒中，構建含增效蛋白基因的重組AcMNPV。2.構建含增效蛋白基因的轉基因植物，提高害蟲對NPV的敏感性。3.在原核細胞中表達增效蛋白。表達產物形成包涵體晶體，穩定且易純化。

本發明的目的是提供一種新型的含有HaGV增效蛋白基因的工程菌株、該菌株的構建方法，以及利用該菌株生產增效蛋白的方法。該工程菌株含有HaGV增效蛋白的基因的表達載體，并能有效表達HaGV增效蛋白。該工程菌株命名為Escherichia?coli?M15(pEHa)，已于2000年4月11同保藏于中國典型培養物保藏中心，登記入冊號為CCTCC?NO：M?201010，該載體由下列DNA元件組成。

(1)棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白基因3′端2.1Kb片段。

(2)大腸桿菌質粒復制起始點。

(3)氨卡青霉素抗性基因。

(4)6個連續組氨酸編碼區。

本發明用于構建HaGV增效蛋白的工程菌株的原材料有如下幾種：

(1)HaGV，由美國湯姆·杰弗遜大學微生物學及免疫學系Zailin?Yu博士贈送。

(2)pQE-30、E.coli?M15(pREP4)，購自QIAGEN公司。

(3)T₄DNA連接酶購自華美生物技術公司。

采用基因工程方法構建含HaGV增效蛋白基因的工程菌株，方法如下：1.HaGV增效蛋白基因的擴增(1)HaGV?DNA的提取

取HaGV懸液100ul，加等體積0.04mol/L?NaOH堿解液及終濃渡為1％SDS，56℃水浴處理10分鐘，待懸液半透明后，用堿性酚、氯仿，異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液抽提HaGV?DNA各一次，用預冷無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置過夜，離心后用75％乙醇洗，干燥沉淀，將DNA溶于TE(10mMTris.1mMEDTA?pH8.0)緩沖液中，-20℃保存。(2)HaGV增效蛋白基因的PCR擴增設計引物如下：

P₁：5′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT?3′

P₂：5′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT?3′

上述引物由上海生工公司合成。按B.M.公司Taq?DNA?Polymerase試劑(從棲熱水生菌YT-1中提純得到的耐熱DNA多聚酶)操作手冊，依次加入：

①10×PCR反應緩沖液10μl；

②兩種引物各2μl；

③10mol/L?dNTPs?2μl；

④Taq?DNA?Polymerase(5U/μl)1μl；

⑤補去離子水至100μl反應體積；

⑥加石蠟油覆蓋液面。