[發明專利]一種乙型肝炎DNA疫苗

無效

• 申請號: 01113087.3
• 申請日: 2001-06-06
• 公開（公告）號: CN1389268A
• 公開（公告）日: 2003-01-08
• 發明（設計）人: 戚中田;趙平;曹潔
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29;C12N15/11;C12N7/01;A61P1/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及生物醫藥技術領域，是具有治療作用的乙型肝炎DNA疫苗。

乙型肝炎病毒(HBV)對人類健康的危害極大，目前全球約有慢性HBV感染者3.5億。以重組乙型肝炎表面抗原作為疫苗的使用，已能有效預防HBV感染，但對于眾多已受感染的的慢性患者，目前尚缺乏有確切療效的藥物。DNA疫苗也稱為基因疫苗或核酸疫苗，是表達微生物抗原的真核重組表達質粒，一些動物和人體的實驗表明DNA疫苗能誘生強的細胞免疫應答，故乙型肝炎DNA疫苗的研制已成為國內外微生物與免疫學領域的一個研究熱點。

HBV的結構蛋白基因包括包膜蛋白基因preS1、preS2、HBsAg和核心蛋白基因HBc，目前報道與此相應的乙型肝炎DNA疫苗主要有四種，包含的基因分別為HBsAg、preS1-preS2-HBsAg、preS2-HBsAg或HBc，但均僅表達包膜蛋白和核心蛋白中的一種，因而不能誘導全面的抗乙肝病毒免疫應答。包含HBsAg的DNA疫苗接種小鼠、黑猩猩均能誘生抗體和細胞免疫應答，美國PowerJect疫苗公司報道用這種DNA疫苗接種健康成年人能誘生低水平的抗體以及T細胞免疫應答。包含preS1-preS2-HBsAg的DNA疫苗誘生免疫應答的效率比包含HBsAg的DNA疫苗差。包含preS2-HBsAg的DNA疫苗經小動物實驗表明其免疫效果與包含HBsAg的DNA疫苗相似。包含HBc的DNA疫苗也僅能在小動物身上才較好地誘生免疫應答。

對慢性HBV感染者來說，由于其體內持續產生HBV抗原，機體免疫系統對于HBV抗原已經形成免疫耐受狀態，因而接種DNA疫苗所產生的HBV抗原的免疫反應性大大低于正常人，故上述乙型肝炎DNA疫苗對于逆轉慢性乙型肝炎患者的免疫耐受狀態和激活HBV抗原特異性T細胞免疫應答的效果不可能理想。對感染HBV的黑猩猩接種包含HBsAg的DNA疫苗的研究也證明了這一點。

本發明的目的是提供一種免疫效力強、對慢性乙型肝炎患者具有治療作用的DNA疫苗。

上述的乙型肝炎DNA疫苗有一個共同不足，即僅表達包膜蛋白和核心蛋白中的一種抗原，若將其聯合就能有效增強細胞免疫應答強度。細胞因子白介素-12(IL-12)在誘導HBV抗原特異性細胞免疫應答中起關鍵作用，所以加上IL-12基因能進一步促進細胞免疫應答的誘導。一些能與人白細胞抗原HLA?II抗原結合的輔助性T淋巴細胞表位能極大促進疫苗的免疫原性。鑒于此，我們將HBV包膜蛋白基因、核心蛋白基因和人IL-12基因共同構建DNA疫苗，并對乙型肝炎病毒包膜-核心蛋白抗原基因進行修飾，即在其5’末端引入了一段編碼人免疫球蛋白IgG?kappa鏈信號肽和通用型輔助性T細胞表位PADRE基因ST的核苷酸序列ATGGGAATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTTTCTGCTCCTCCTGTGGGTGCCCGGGTCCAGAGGAGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTGGATCC，以進一步激活慢性乙型肝炎患者體內對HBV包膜蛋白和核心蛋白表現為低反應性的T淋巴細胞。

本發明構建的乙型肝炎DNA疫苗含有信號肽基因和通用型輔助性T淋巴細胞表位基因ST、HBV包膜蛋白基因preS1-preS2-HBsAg(簡稱為S1S2S)、HBV核心蛋白基因HBc和人IL-12基因hIL-12。該DNA疫苗的轉錄調控結構包括人巨細胞病毒早期啟動子和增強子PCMV、一段合成的內含子intron、內部核糖體進入位點序列IVS-IRES和猴病毒SV40的轉錄終止信號基因序列SV40?polyA。

附圖說明：

圖1為本發明乙型肝炎DNA疫苗的結構示意圖。

圖2為本實驗室構建的編碼HBV包膜蛋白和核心蛋白的重組質粒pUC-S1S2S和pUC-HBc的結構示意圖。

圖3為編碼人免疫球蛋白IgG?kappa鏈信號序列和通用型輔助性T細胞表位的DNA片段ST的制備流程圖。

圖4為重組質粒pcDNA-ST的構建流程圖。

圖5為重組質粒pcDNA-ST-HBc的構建流程圖。

圖6為重組質粒pcDNA-ST-S1S2S-HBc的構建流程圖。

圖7為重組質粒pCI-hIL12的構建流程圖。

圖8為重組質粒pCI-IRES-hIL12的構建流程圖。

圖9為重組質粒pCI-ST-HBV-hIL12的構建流程圖。

本發明采用重疊延伸PCR、PCR、酶切、連接等分子生物學實驗方法構建DNA疫苗，可參考美國薩姆布魯克著《分子克隆》第二版。