[發明專利]一種基因重組抗凝血蛋白無效

申請號：	01112959.X	申請日：	2001-05-23
公開（公告）號：	CN1386752A	公開（公告）日：	2002-12-25
發明（設計）人：	孫樹漢;顏宏利;陳蕊雯;張毅	申請（專利權）人：	中國人民解放軍第二軍醫大學
主分類號：	C07K14/435	分類號：	C07K14/435;C07K14/47;A61P7/02
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地址：	20043***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種基因重組抗凝蛋白
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【說明書】：

本發明涉及醫藥生物技術領域，是一種由膜聯蛋白32基因(annexin32)改造后表達的具有抗凝血和血栓靶向功能的抗凝血蛋白。

血栓癥，如急性心肌梗塞(AMI)、靜脈血栓栓塞等是一類嚴重危及人類健康及生命的心血管疾病。目前的抗血栓藥物主要分為溶栓藥和抗凝血藥。抗凝血藥按作用機理可分為三類：(1)凝血酶間接抑制劑，如肝素；(2)凝血酶直接抑制劑，如重組水蛭素；(3)維生素K拮抗劑，如華法林等。前兩類藥物主要的靶向位點是凝血酶，雖然抗凝效果明顯，但體內半衰期短，且常常會引起出血等不良反應。華法林等主要通過阻礙維生素K的代謝，間接起到抗凝血目的。這種藥物的缺點是起效慢，且常常會引起出血和皮膚壞死。因而目前這些抗凝血藥物都不很理想。

70年代末從人的胎盤組織中發現的膜聯蛋白(Annexins)是一類具有較強抗凝血活性的蛋白家族。其抗凝機理為：在血液凝固的“瀑布式”反應中，血小板首先活化，磷脂膜的不對稱性發生改變，原來在血小板內側的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露。凝血因子IX、X在鈣離子存在的情況下，和血小板磷脂酰絲氨酸結合后被激活。而膜聯蛋白在鈣離子存在時，同樣可迅速和酸性磷脂如磷脂酰絲氨酸結合，從而競爭性抑制凝血因子IX、X同血小板膜磷脂的結合，抑制凝血因子的激活。進而抑制凝血酶的形成，達到抗凝血的目的。與傳統的抗凝血藥物相比，膜聯蛋白通過競爭血小板膜磷脂而間接抑制凝血酶的形成，不破壞凝血因子的活性，因而不會產生由凝血因子的減少而引起的出血等副作用。同時，利用膜聯蛋白可特異性識別并結合活化血小板所暴露的酸性膜磷脂，因而可以用于以活化血小板為主的動脈血栓的導向顯像；還可以膜聯蛋白為載體，與溶血栓藥物如t-PA等結合，發展血栓靶向的溶栓藥物。

本發明的目的在于根據上述膜聯蛋白具有抗凝血和血栓靶向功能的特性，提供一種抗凝活性強、出血等副作用小、成本低廉的抗凝血蛋白，以進一步用于抗凝血藥物的制備。

本發明抗凝血蛋白是通過對豬囊尾蚴cDNA文庫中克隆到的膜聯蛋白32基因(annexin32)改造后在大腸桿菌內表達的重組蛋白。annexin32cDNA序列已在GeneBank登錄，登錄號：AF147955。此基因編碼347個氨基酸的蛋白質，分子量38kDa。利用大腸桿菌原核表達系統表達的膜聯蛋白32，經小鼠動物實驗表明，具有較強的抗凝血活性，且未見引起實驗小鼠的出血反應。膜聯蛋白32的結構分析表明，除了N端27個氨基酸短肽外，其余320個氨基酸形成4個結構相似的結構域I，II，III，IV，每一個結構域都包含一個相對獨立的鈣磷脂結合位點。本發明人設想：如果將該蛋白去除N端的27個氨基酸和上述4個結構域中的某一個，是否可以既保留其抗凝血活性，又由于分子量的減小，而減小異源蛋白的抗原性所引起的不良反應呢？基于上述設想，本發明人對annexin32進行了基因改造，構建了一系列序列缺失突變體。突變體在大腸桿菌表達后進行了抗凝活性檢測，發現其中去除了N端27個氨基酸和C端第四個結構域的重組蛋白具有較好的抗凝血活性。本發明即為選用該基因突變體在大腸桿菌中所表達的重組蛋白。在此，突變體基因用tanx32表示，該突變體基因在大腸桿菌中表達的重組蛋白用TANX32表示。TANX32由251個氨基酸組成，分子量為27kDa。

附圖說明：

圖1為annexin32全基因cDNA序列和相對應的氨基酸編碼序列

??上一列為cDNA序列，長度：1044bp；

??下一列為對應的氨基酸序列，長度：347個氨基酸。

圖2為重組基因tanx32?cDNA序列和相對應的氨基酸編碼序列

??上一列為cDNA序列，長度：756bp；

??下一列為對應的氨基酸序列，長度：251個氨基酸

圖3為利用同源建模方法建立的TANX32的分子結構圖

圖4為熱誘導型原核表達質粒pJM-tanx32的構建流程圖

圖5為KPTT檢測TANX32的抗凝血活性實驗結果

圖6為兔血栓模型檢測TANX32的抗凝血活性試驗結果

下面結合附圖，對本發明的制備方法作詳細敘述。