[發明專利]分析扇貝的系統發育譜系的方法

無效

• 申請號: 01110897.5
• 申請日: 2001-03-09
• 公開（公告）號: CN1322845A
• 公開（公告）日: 2001-11-21
• 發明（設計）人: 長島浩二;佐藤希實
• 申請（專利權）人: 北海道漁業協同組合連合會;長島浩二
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

1．一種分析扇貝譜系的方法，該方法包括測定扇貝線粒體DNA的序列以確定線粒體DNA的核苷酸堿基序列。

2．根據權利要求1的方法，其中所說的核苷酸堿基序列包括其中含有核苷酸堿基取代座位的非編碼區，所說的核苷酸堿基取代座位顯示作為所說扇貝特定譜系的指征的序列多態性的指征，并且其中測定所說的非編碼區的序列以定位其中的核苷酸堿基取代座位。

3．根據權利要求1的方法，其包括下列步驟：

從所說扇貝的閉殼肌中提取作為模板DNA的總DNA；

使用基于已知有殼水生動物線粒體16S?rRNA基因和12S?rRNA基因間保守的核苷酸堿基序列設計的適當引物組，在聚合酶鏈反應下從所說的模板DNA擴增線粒體DNA；

測定如此擴增的線粒體DNA的序列同時確定其中的非編碼區，以便確定線粒體DNA的核苷酸堿基序列；

然后，使用基于所說的擴增的線粒體DNA的核苷酸堿基序列設計的適當引物，測定所說的非編碼區的序列；

定位所說非編碼區中的核苷酸堿基取代座位，并且

由所說的核苷酸堿基取代座位確定序列多態性，從而分析所說的扇貝的特定譜系。

4．根據權利要求3的方法，其中所說的擴增的線粒體DNA是使用載體由大腸桿菌克隆，然后用染料終止方法測序的。

5．根據權利要求3的方法，其中所說的擴增的線粒體DNA是未經克隆而用染料終止法直接測序的。

6．根據權利要求3的方法，其中所說的擴增的線粒體DNA和所說的非編碼區都是用染料終止法測序的。

7．根據權利要求3的方法，其中所說的扇貝是以多數給出的，以提供許多不同的扇貝，并且其中所說的多種不同扇貝的各線粒體DNA分別都是使用所說的適當引物組，經所說的聚合酶鏈反應擴增的，其后不經克隆而使用所說的適當引物以染料終止法直接測定線粒體DNA非編碼區的序列，從而定位所說的多數不同扇貝間的所說非編碼區中的多個不同的核苷酸堿基取代座位。

8．根據權利要求3的方法，其中所說的扇貝是日本扇貝Patinopecten?yessoensis，其中所說的適當引物組包括Pyso?16S?BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)和Pyso?12S?BR引物(5′-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3′)，并且其中所說的適當引物包括Pyso?16S?BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)、Pyso?NcR引物(5′-AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3′)和Pyso?12S?AR引物(5′-ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3′)。

9．根據權利要求3的方法，其中所說的扇貝是日本扇貝Patinopecten?yessoensis，其中所說的適當引物組包括Pyso?16S?BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)和Pyso?12S?BR引物(5′-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3′)，并且其中所說的適當引物包括Pyso?16S?BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)、Pyso?NcR引物(5′-AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3′)和Pyso?12S?AR引物(5′-ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3′)，其中所說的日本扇貝以多數給出以提供許多日本扇貝，其中所說的許多日本扇貝被分成至少一個扇貝群體，其中，在所說的擴增線粒體DNA的步驟中，使用所說的Pyso?16S?BF和Pyso?12S?BR引物組擴增所說的至少一個扇貝群體的各自的線粒體DNA，從而確定所說的各至少一個扇貝群體中的約1.3kbp線粒體DNA，其中，在所說的測定如此擴增之線粒體DNA的序列的步驟中，確定所說的大約1.3kbp線粒體DNA的核苷酸堿基序列，同時確定其中的非編碼區，并且其中在測定非編碼區的序列的步驟中，使用所說的Pyso?16S?BF、Pyso?NcR和Pyso?12S?AR引物測定所說的非編碼區的序列；以便定位所說的各至少一個扇貝群體非編碼區中的核苷酸堿基取代座位，從而確定其中的序列多態性，并將所說的至少一個扇貝群體中的許多日本扇貝分類為特定的譜系。