[發明專利]豬胰島細胞DNA的制備方法及作為治療糖尿病藥物的應用

無效

• 申請號: 01110269.1
• 申請日: 2001-04-05
• 公開（公告）號: CN1329170A
• 公開（公告）日: 2002-01-02
• 發明（設計）人: 姚文彬;吳以嶺;田書彥;曹月青;胡建立
• 申請（專利權）人: 河北以嶺醫藥研究院
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;A61K31/7088;A61P3/10
• 代理公司: 河北省科技專利事務所
• 代理人: 王琪

本發明涉及豬胰島細胞DNA的制備方法及作為治療糖尿病藥物的應用，屬于生物制藥技術領域。

應用胰島細胞DNA作為治療糖尿病藥物的研究方面，已有關于胎兒胰腺全DNA介導的胰島素基因轉染及表達的研究，并取得初步成果的報道。另有美國、加拿大利用人體細胞DNA治療心血管疾患已進入臨床實驗階段的報道。胎兒胰腺全DNA介導的胰島素基因轉染及表達的研究，主要問題在于供體來源問題，我國目前的人口政策和醫療水平的不斷提高中期引產和終止妊娠例數將愈來愈少，供體來源匱乏會非常明顯。在臨床上利用豬胰島細胞移植治療糖尿病亦有相關報道，存在的問題是異種免疫排斥要靠大量藥物維持。

本發明的目的是利用豬胰島細胞，特別是β細胞(主要合成與分泌胰島素細胞)提取具有活性的胰島素功能基因組基因的方法及制備治療糖尿病的藥物，以解決胰島細胞DNA供體來源和降低異種免疫排斥問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：豬胰島細胞DNA的制備方法是：a.取豬胰活體組織，液氮冷凍研磨；b.加入細胞裂解液和0.1mg/mL蛋白酶K于37℃振蕩15-18小時；C.加入苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1于4℃離心抽提20分鐘，取上清液；d.加入等體積氯仿于4℃離心抽提20分鐘，取上清液，重復2次；e.加入1/2體積7.5M乙酸銨、2倍體積無水乙醇，取懸浮DNA；f.?70％乙醇洗滌2次g.冷凍干燥h.?-20℃冷凍保存備用。

所述的豬胰島細胞DNA的制備方法，其特征在于所述的細胞裂解液的組成是100mmol/L?NaCl，10mmol/L三羥甲基胺基甲烷(Tris)，25mmol/L?EDTA，0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)。

所述的豬胰島細胞DNA作為治療糖尿病藥物的應用，其特征是豬胰島細胞DNA可以作為臨床上治療糖尿病的藥物原料。

所述的豬胰島細胞DNA作為治療糖尿病藥物的應用，其特征是豬胰島細胞DNA可以制成臨床上治療糖尿病的凍干粉末制劑形式、靜脈及肌肉注射溶液制劑形式、脂質體制劑形式、微膠囊制劑形式。

本發明利用豬胰島細胞，特別是β細胞(主要合成與分泌胰島素細胞)里具有活性的胰島素功能基因組基因，經體內肝細胞及肌組織的直接轉染實驗研究，比較胎兒胰腺全DNA它可以很好地解決供體來源，而對比豬胰島細胞移植可降低異種免疫排斥問題，并較之單純胰島素基因，可能更有效地起到調控作用控制血糖變化。

下面結合流程圖詳細說明本發明的實施例：

圖1為豬胰島細胞DNA的提取及制備工藝流程圖

制備方法是：取活體豬胰體及胰尾部組織10g(即：β細胞主要存在部位)，液氮迅速冷凍研磨，加入細胞裂解液12ml(100mmol/L?NaCl，10mmol/L三羥甲基胺基甲烷(Tris)，25mmol/L?EDTA，0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)，pH8.0，購自北京化學試劑公司)，0.1mg/mL蛋白酶K，購自Sigma公司)于37℃恒溫、輕微振蕩15-18小時，加入等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提(購自北京化學試劑公司)，溫度控制在4℃、離心力20000g、離心20分鐘，取上清；再進行等體積氯仿抽提，溫度控制在4℃，離心力20000g，離心20分鐘，取上清，重復以上抽提步驟一次，取上清；加1/2體積7.5mol/L乙酸銨，2倍體積無水乙醇(購自北京化學試劑公司)，取懸浮DNA，用70％乙醇洗滌2次；冷凍干燥，-20℃冷凍保存備用。

上述工藝制備的凍干豬DNA粉末可以作為制備治療糖尿病藥物的原料，如用于合成胰島素；還可以作為制備臨床上應用的治療糖尿病的制劑，如粉針劑、或溶于生理鹽水中制備注射用制劑，還可以與其它藥物結合制備脂質體、微膠囊等臨床上適用于治療糖尿病的藥物制劑形式。