[發(fā)明專利]狄喬治氏綜合癥的相關(guān)新基因及其蛋白

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01109874.0
• 申請日: 2001-03-22
• 公開（公告）號: CN1314468A
• 公開（公告）日: 2001-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王以光;龔利民;葉冰冰
• 申請（專利權(quán)）人: 北京豐科盛功能基因技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/70;C12N15/79;C07K16/18;C07K14/47;C07H21/00;A61K38/17;A61K31/7088;A61K48/00;A61P9/00
• 代理公司: 北京科龍環(huán)宇專利事務(wù)所
• 代理人: 楊厚,孫皓晨

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及采用酵母雙雜交系統(tǒng)和EST-PCR-RACE克隆技術(shù)尋找小兒先天性心臟病的相關(guān)基因以及在狄喬治氏綜合癥(DGS-DiGeorge?syndrome)的診斷和治療中的應(yīng)用。

先天性心臟病(CHD-congenital?heart?disease)是所有人類生育缺陷中最常見的疾病。每年約有3萬多新生兒患有CHD病，它是出生后第一年引起死亡的最主要原因。狄喬治氏綜合癥是先天性心臟病的典型代表之一。在新生兒其發(fā)病率是四千分之一[Pediatric?Research?48:717-724,2000]。該綜合癥主要表現(xiàn)在耳朵畸形、腭裂、副甲狀腺發(fā)育不足、胸腺-T細(xì)胞缺損、間斷性主動(dòng)脈弓、溢出徑畸形以及胸腺發(fā)育不全。絕大多數(shù)(90％)狄喬治氏綜合癥患者具有染色體22q11.2區(qū)域的缺失，其長度達(dá)3百萬堿基對(3-Mb)[Current?protocols?in?molecular?biology1996；J?Endocrinology?1998,139:4870-4880；Am?J?Hum?Genet,61:620-629,1997]。也有部分病人存在約2百萬堿基對(2-Mb)的缺失，但缺失的部位與常見缺失部位僅有部分區(qū)域相同，如圖1所示。另有報(bào)道稱，染色體17p13位點(diǎn)的缺失也能引起類似DGS癥狀[Am.J.Med.Genet.31:1-4,1988]

雖然，狄喬治氏綜合癥已經(jīng)研究了三十多年，并且證明染色體22q11.2和17p13缺失與該疾病有關(guān)，可是到目前為止沒有任何單一基因被證明能引起該綜合癥。某些基因，例如HIRA和UFDIL存在于22q11.2部位，并且是在DGS患者受到影響的組織中得到表達(dá)[Circ?Res?84:127-135,1999,Science?283:1158-1161]。然而，鼠單缺失HIRA或UFDIL顯然屬于正常情況[Nature?401:379-383,1999]。由于大部分病人被檢測到的缺失達(dá)幾百萬堿基對，越來越多的證據(jù)表明，這一綜合癥可能是由多基因聯(lián)合控制的[Pediatric?Research?48:717-724,2000]。

本發(fā)明闡明了三個(gè)與DGS相關(guān)的基因FKSG1、FKSG3和FKSG4的克隆、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定和制備。其目的是提供三種新的多核苷酸序列，提供三種新的蛋白以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述新蛋白的方法，同時(shí)還提供這些新基因和蛋白在診斷和治療狄喬治氏綜合癥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的內(nèi)容與技術(shù)方案如下：1?DGS相關(guān)基因FKSG1的克隆

為了鑒別存在于DGS病人經(jīng)常缺失的22q11.2區(qū)域內(nèi)的新基因，本發(fā)明采用了一種特殊的cDNA克隆方法[Life?Sciences63(17):1555-1562,1998]。該方法綜合采用了cDNA選擇、EST(expressed?sequence?tag)定位、基因組DNA序列分析、PCR反應(yīng)以及克隆末端延展(RACE-Rapid?amplification?of?cDNA?ends)等技術(shù)。本發(fā)明根據(jù)所涉及的幾個(gè)要素的組合從NCBI的EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)果表明存在217個(gè)陽性克隆片段，用來自每一個(gè)陽性克隆的cDNA片段與NCBI的GenBank中所報(bào)道的已知基因進(jìn)行比較，進(jìn)一步分析比較結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)EST克隆(AA312178)含有328個(gè)堿基對，該序列與任何已知的序列均不相同，但存在于基因組序列片段(AC000089)。如圖1所示，AC000089存在于DGS病人常缺失區(qū)域。AA312178在AC000089片段中存在于3個(gè)不同的部位。AA312178中的頭96個(gè)堿基與AC000089片段中37192-37094部位的堿基完全相同；AC312178中的97-259堿基與AC000089片段中28946-28783部位的堿基一樣；而AA312178中的最后部位260-328與AC000089中23255-23228區(qū)域的堿基相吻合。這些結(jié)果表明，EST?AA312178克隆含有1個(gè)未知新基因的部分片段，用AA312178的核苷酸序列進(jìn)一步查詢EST數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，AI870670克隆與AA312178部分相重疊。

繼而合成了兩個(gè)引物：引物A：5’-TCGGTCTCTGGACGCTGCGCGGCG-3’來自AA312178(SEQ?ID

???NO.1)????引物B：5’-CGTCTTGGAGGGCATCTCCAGAAT-3’來自AI870670(SEQ?ID