[發(fā)明專利]具有血管生成抑制作用的融合蛋白

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 01108794.3
• 申請(qǐng)日: 2001-08-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1338473A
• 公開(kāi)（公告）日: 2002-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳靜嫻;吳緯;宋寧;焦麗華;王憬惺;簡(jiǎn)涌;楊剛虹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川楊天生物藥業(yè)股份有限公司;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C07K14/515;C12N15/09;C12N15/62;C12N15/85;C12P21/02
• 代理公司: 成都立信專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 濮家蔚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種重組蛋白產(chǎn)物，具體講是一種具有血管生成抑制作用的融合蛋白。

背景技術(shù)

正常的血管增生只限定于特定的情況，如外傷，胚胎形成，女性的生殖周期。血管的異常增殖可導(dǎo)致一系列的疾病，如腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，糖尿病性視網(wǎng)膜增生，血管疾病如血管瘤，動(dòng)脈粥樣硬化，變態(tài)反應(yīng)性疾病如關(guān)節(jié)炎等。

1971年Folkman教授首先提出了腫瘤的生長(zhǎng)依賴血管的假設(shè)，多年來(lái)的研究結(jié)果已充分證明了這一理論。抑制血管生成，就可切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和血道轉(zhuǎn)移途徑，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。1994年，F(xiàn)olkman實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)38KD的纖溶酶原片段angiostatin能夠特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管形成，并能顯著抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)(O′Reilly?M?S，Holmgren?L，Shing?Y，et?al.Cell，1994；79：315-328)。隨著研究的逐步深入，有關(guān)報(bào)導(dǎo)不斷出現(xiàn)。如，WO96/35774公開(kāi)了有關(guān)angiostatin及聚體的作用和使用方法；WO98/54217公開(kāi)了angiostatin片段的使用；US?5,776,704公開(kāi)了檢測(cè)angiostatin的方法；US?5,801,012公開(kāi)了angiostatin的產(chǎn)生方法；WO99/16889公開(kāi)了angiostatin融合蛋白磁療腫瘤的作用，其前導(dǎo)肽為白介素3(IL-3)等。

人的血漿纖維蛋白溶酶原包含了Kringle?1-5。Kringle位點(diǎn)是3個(gè)環(huán)狀相連的二硫鍵結(jié)構(gòu)，每個(gè)Kringle包含約80個(gè)氨基酸，各個(gè)Kringle有50％左右的序列相同。不同Kringle結(jié)構(gòu)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的抑制能力順序?yàn)椋籏5＞K1＞K3＞K2＞K4(Cao?et?al.J.Biol.Chem，271：29461-29467，1996；Cao?et?al.J?Biol?Chem272：22924-22928，1997)。如，在WO99/00420中公開(kāi)了K1-5體內(nèi)調(diào)節(jié)血管生成的作用；US?5,801,146中公開(kāi)了K5在抑制血管生成方面的作用；WO97/41824中公開(kāi)了一種治療血管生成疾病的哺乳動(dòng)物K5片段和融合蛋白。

人體的免疫球蛋白Fc區(qū)域已成功與多種目標(biāo)蛋白融合并表達(dá)成功，包括IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，β1G-H3，IgE受體，PSMA和gp120(U.S.PatentNo.5,541,087and?U.S.Patent?No.5,726,044)。Fc區(qū)域包括CH1，CH2，CH3，CH4和Hinge區(qū)。常用類別為IgG的CH2，CH3及Hinge區(qū)，其余類別IgA，IgD，IgE和IgM也可使用。Fc區(qū)域能夠增加融合蛋白的表達(dá)量，增強(qiáng)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期。

上述人體內(nèi)源性的抗血管生成因子，一方面顯示出很好的應(yīng)用前景，體外顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，體內(nèi)顯著抑制了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)，無(wú)毒副作用，反復(fù)使用體內(nèi)不產(chǎn)生抗藥性，與傳統(tǒng)的放療、化療相比，具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值；但另一方面，由于其穩(wěn)定性和用藥量的問(wèn)題，又在一定程度上限制了臨床的廣泛使用性。與一般細(xì)胞因子臨床用量微克級(jí)相比，血管生成抑制因子臨床有效用量一般都在毫克級(jí)，相差千倍。另外，由于是內(nèi)源性的蛋白多肽片段，其活性也易于丟失。

發(fā)明內(nèi)容

根據(jù)上述情況，本發(fā)明將提供一種可被應(yīng)用于臨床的高表達(dá)，高活性，高穩(wěn)定性的具有血管生成抑制作用的不同結(jié)構(gòu)形式的融合蛋白。

本發(fā)明所稱的具有血管生成抑制作用的融合蛋白的核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列為S-Fc-K5形式，其中：S為人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)集落胞刺激因子(hGM-CSF)前導(dǎo)肽，F(xiàn)c為人免疫球蛋白IgG?Fcγ，K5為人血漿纖維蛋白溶酶原內(nèi)的片段K5。該S-Fc-K5融合蛋白的核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列為；

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