[發(fā)明專利]用羥胺切割融合蛋白的方法制備重組甲狀旁腺激素

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01107808.1
• 申請日: 2001-02-20
• 公開（公告）號: CN1371918A
• 公開（公告）日: 2002-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王革
• 申請（專利權(quán)）人: 王革
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組多肽藥物。

甲狀旁腺激素(Parathyroid?hormone，簡稱PTH)是維持人機(jī)體血鈣平衡的重要激素之一，它能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長因子生成從而促進(jìn)骨形成，因而被用于治療骨質(zhì)疏松癥。臨床結(jié)果表明注射PTH可顯著增加絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松病人腰椎的骨礦物質(zhì)密度(BMD)及骨礦物質(zhì)含量(BMC)。PTH是能引起骨質(zhì)疏松婦女骨增長的新藥。

目前，用基因工程方法生產(chǎn)PTH是唯一有效的途徑。但重組的PTH在大腸桿菌中直接游離表達(dá)時(shí)有很大困難。為了表達(dá)PTH我們使用融合蛋白的方法，即在PTH?N端前加入一段前導(dǎo)肽，構(gòu)成融合蛋白，以使PTH得以高效表達(dá)，然后再將融合蛋白中的前導(dǎo)肽切掉，產(chǎn)生完整的PTH。

本發(fā)明的原理：羥胺作為價(jià)格低廉的蛋白切割化學(xué)試劑，可以專一性地切開蛋白與多肽中的Asn-Gly肽鍵。

本發(fā)明的目的：用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)重組PTH的融合蛋白，并在融合蛋白的前導(dǎo)肽與PTH之間的結(jié)合部位插入化學(xué)試劑切割位點(diǎn)，以使生產(chǎn)成本降低，純化工藝簡化。

技術(shù)方案：我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PTH多肽中不含有羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly肽鍵，這樣我們在融合蛋白的前導(dǎo)肽與PTH的連接處即PTH的N端引入羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly(AACGGG)，在用大腸桿菌高效表達(dá)PTH的融合蛋白后，再用羥胺進(jìn)行切割，釋放出重組PTH，且具有天然的生物學(xué)活性。經(jīng)上述改造后轉(zhuǎn)化的工程菌種，在發(fā)酵表達(dá)后，經(jīng)菌體收集→菌體破碎→離心分離→羥胺切割→離子交換層析等純化步驟，可制備得到純度大于95％的重組PTH。

最佳實(shí)施例：

在構(gòu)建PTH融合蛋白的克隆過程中，在PTH的前面放置大腸桿菌硫氧還蛋白(thioredoxin)作為前導(dǎo)肽，在thioredoxin和PTH之間引入羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly。將上述改造后的PTH融合蛋白cDNA放在表達(dá)載體pThioHisA中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，用IPTG誘導(dǎo)的方式可高效表達(dá)產(chǎn)生PTH融合蛋白，表達(dá)水平達(dá)30％，同時(shí)thioredoxin引導(dǎo)融合蛋白以可溶狀態(tài)存在于大腸桿菌的細(xì)胞漿中，且具天然活性。這一優(yōu)勢可以免去包涵體形式的蛋白所需的變性、復(fù)性及異構(gòu)體分離等問題。在用羥胺切割后，產(chǎn)生完整的PTH。這樣純化工藝得以簡化，生產(chǎn)成本大大降低。

表達(dá)和制備方法如下：在菌種平板上挑取一單菌落，接種于2mlLBA培養(yǎng)基中(LBA：每升含10g蛋白胨，5g酵母膏，5gNacl，60mg氨芐青霉素，pH7.0)，37度生長至O.D600＝0.5時(shí)，加入IPTG至1mM誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，離心收獲菌體，將菌體懸浮在50mMPB(Na₂HPO₄+NaH₂PO₄，pH8.0)緩沖液中，超聲破碎菌體，20000×g，20分鐘離心。取上清，加入羥胺至2M，調(diào)pH7-9，在37-45度下切割2-20小時(shí)，釋放出完整的PTH。透析后再用陽離子柱CM-Sepharose進(jìn)一步純化，用0-1M?NaCl，20mMPB，pH8.0線性梯度洗脫，在0.25mM?NaCl左右濃度處洗下PTH活性峰。通過上述方法，可以得到高純度，天然活性的重組PTH。

本發(fā)明提供了一種用融合蛋白方式表達(dá)和切割制備甲狀旁腺激素的方法。它具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、融合蛋白切割劑為廉價(jià)的化學(xué)試劑—羥胺。2、本工藝采用的羥胺為小分子無機(jī)物質(zhì)，不帶來異源蛋白污染。3、由上述二個(gè)特點(diǎn)決定了本工藝純化方便且成本低廉。上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新和工藝先進(jìn)性，適合于工業(yè)化生產(chǎn)且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。