[發明專利]一種能表達人促生長因子基因的轉基因植物的獲得方法

無效

• 申請號: 01107400.0
• 申請日: 2001-04-30
• 公開（公告）號: CN1384198A
• 公開（公告）日: 2002-12-11
• 發明（設計）人: 范彬
• 申請（專利權）人: 張濤;范彬
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/74;C12N5/10;C12N15/12;A01H1/00
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所
• 代理人: 李高峽

本發明涉及一種能表達人促生長因子基因的轉基因植物的獲得方法，特別是能表達hEGF基因的轉基因植物的獲得方法。

目前美容品的美容成分，一般是分別提取人促生長因子如hEGF等和植物中的具美容作用的成分，再將兩者混合，工藝復雜，生產成本較高。

本發明的目的是為了克服上述工藝復雜，生產成本較高的缺點而提供一種方法，得到含人促生長因子基因的轉基因植物，利用某些具有美容作用的植物如蘆薈、胡蘿卜、番茄等作生物發生器，在植株內表達具有活性的人促生長因子，同時可利用植物本身的美容成分，從而得到具有良好美容作用的植物提取物，并且方法簡單，成本較低。

本發明的目的是這樣實現的，先將人促生長因子hEGF基因克隆進puc18質粒，得到hEGF/puc18中間載體，再將該中間載體和pPZP111G質粒再連接組成植物表達載體hEGF/pPZP111G，將該植物表達載體轉化到根癌農桿菌中，再用該轉化后的根癌農桿菌轉化目的植物，經篩選得到能表達人促生長因子hEGF基因的植物細胞株，再由細胞株培養為轉基因植物。

用有hEGF/pPZP111G的根癌農桿菌轉化蘆薈，得到含有hEGF基因的蘆薈愈傷組織，再由愈傷組織培育出含hEGF基因的轉基因蘆薈。

用有hEGF/pPZP111G的根癌農桿菌轉化胡蘿卜，得到含有hEGF基因的胡蘿卜愈傷組織，再由愈傷組織培育出含hEGF基因的轉基因胡蘿卜。

用有hEGF/pPZP111G的根癌農桿菌轉化番茄，得到含有hEGF基因的番茄愈傷組織，再由愈傷組織培育出含hEGF基因的轉基因番茄。

下面通過實施例進一步說明本發明的轉基因植物的獲得方法。本發明所提供的方法步驟如下：

一、從人腦cDNA文庫中經PCR法獲得hEGF基因，并在5’、3’端分別引入EcoRI和BamHI酶切位點，在5’、3’端分別引入起始碼和終止碼。

根據hEGF設計一對引物：

正向引物F是5’GCGAATTCATGAATAGTGACTCTGAATG3’，

反向引物R是5’CGGGATCCTTAGCGCAGTTCCCACCAC3’，PCR反應條件為：94℃預變性5分鐘，94℃變性40秒，58℃變性40秒，72℃延伸40秒，共30個循環，最后72℃延伸5分鐘。PCR產物經EcoRI和BamHI雙酶切后連接到載體puc18中，測序后確定組成中間載體hEGF/puc18，保存中間載體hEGF/puc18。

二、構建植物表達載體并轉化根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)：

將中間載體hEGF/puc18和pPZP111G質粒雙酶切，再連接組成植物表達載體hEGF/pPZP111G，通過凍融法轉化到根癌農桿菌LBA4404中。三、轉化目的植株1、轉化蘆薈(Aloeferox?Mill好望角蘆薈)

挑取含hEGF/pPZP111G的單菌落，放入10ml加100ml/L利福平，300ml/L鏈霉素，50ml/L硫酸卡那霉素的YEB液體培養基中，于28℃，150r/min恒溫振蕩培養過夜。當OD600為0.6時收集菌液，4000r/min離心10min，沉淀重懸于1/2?MSO液體培養基中。

將低溫處理過的蘆薈的子葉和下胚軸切成0.5cm長短，浸沒于上述菌液中，5min后取出，吸去多余菌液，接種在附加1mg/L?2，4-D和0.2mg/L激動素(KT)的固體培養基MSD1上，于26℃，黑暗條件下共培養兩天。

共培養后吸干外植體表面的菌液，接種到附加50ml/L硫酸卡那霉素和500ml/L羧芐青霉素的MSDI固體培養基上，2-3星期后轉接到附加50--100ml/L硫酸卡那霉素和300ml/L羧芐青霉素的MSDI培養基上，誘導抗性愈傷組織的形成，將抗性愈傷組織培養在含100ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧芐青霉素的MSDI固體培養基上，每2--3星期傳代一次，經2-3次繼代培養后，把抗性愈傷組織轉入附加25ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧芐青霉素的MSO固體培養基上誘導分化，30天后通過胚狀體發育獲得抗性植株，抗性植株在廣口瓶中生長發育7-8片真葉后，移栽盆中，于溫室種植。2、轉化胡蘿卜(Daucus?carota)