[發明專利]咔唑生物堿類細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑及其制備

在審

• 申請號: 01103675.3
• 申請日: 2001-02-09
• 公開（公告）號: CN1309964A
• 公開（公告）日: 2001-08-29
• 發明（設計）人: 崔承彬;蔡兵;閆少羽;趙慶春;姚新生;曲戈霞
• 申請（專利權）人: 崔承彬
• 主分類號: A61K31/403
• 分類號: A61K31/403;A61K31/407;A61P35/00;A61P43/00;C07D209/82;C07D491/02
• 代理公司: 北京市海淀區專利事務所
• 代理人: 張濤,陸濱芊

本發明涉及一類新的用于細胞周期抑制和細胞凋亡誘導的組合物，特別是一類含咔唑生物堿衍生物的組合物及其制備。

咔唑類生物堿雖然有一些化合物已人工合成，但大多還主要來源于天然產物，而且對某些結構類型的咔唑類化合物已有人進行了部分生物活性的研究，如文獻Tian-Shung?Wu,et?al,Carbazole?alkaloids?from?Clausena?excavata?and?their?biological?activity:Phytochemistry,Vol.43.No.1.pp133-140,1996及文獻A.Chakraborty,et?al,Carbazole?alkaloid?with?antimicrobial?activity?from?Clausena?heptaphylla:Phytochemistry,Vol.38.No.3.pp787-789,1995曾報道這類化合物具有抗菌作用和血小板聚集抑制作用。但有關天然咔唑生物堿類化合物的生物活性至今未見有細胞周期抑制及細胞凋亡誘導等抗癌作用的研究報道。

天然咔唑類生物堿很多都來源于蕓香科(Rutaceae)黃皮屬(Clausena)植物。迄今該屬植物化學成分的研究報道很多，主要成分為咔唑類生物堿和香豆素類化合物。同屬植物黑果黃皮Clausena?dunniana?Levl在我國局部地區民間用于治療癌癥，但其化學成分特別是有關該植物抗癌活性成分的研究至今未見報道。

本發明的目的是研制一類新的用于細胞周期抑制和細胞凋亡誘導的物質，特別是一類咔唑生物堿衍生物及其制備。

本發明首次發現黑果黃皮的粗提物有很好的細胞周期抑制、細胞凋亡誘導及一定的細胞毒等抗癌活性，遂對其相關抗癌活性成分進行了系統的研究，并發現了下述四種結構類型的咔唑類生物堿，具有細胞周期抑制和細胞凋亡誘導作用，其結構如下：

用上述化合物作為主要活性成分，配之以藥物可接受的輔劑、賦形劑，可以制成一類新型的細胞周期抑制劑和細胞凋亡誘導劑。

上述化合物的制備方法是用適量乙醇或含水乙醇溶液提取黑果黃皮莖皮的干燥碎塊，得粗浸膏，將所得粗浸膏依次用有機溶劑萃取，得到提取物。將上述有機溶劑提取物經反復的硅膠和Sephadex?LH20柱層析、反復的制備硅膠薄層層析和重結晶等分離純化操作，分離出浸膏中的活性成分，得到上述四種結構類型的咔唑類生物堿活性單體。

本發明采用流式細胞術并配以細胞顯微形態特征觀察、熒光顯微形態特征觀察及顆粒粒度分析法，以對tsFT210小鼠乳腺癌細胞的細胞周期抑制、細胞凋亡誘導以及對該癌細胞的殺傷作用為主要指標進行了抗癌活性的篩選和測試工作。同時，采用HT-1080、K562等人癌細胞系，用MTT法檢測了活性成分對人癌細胞的殺傷作用。結果表明，本專利所提供的上述四種結構類型的咔唑類生物堿在所測試的抗癌活性模型中均具有很好的相關活性。

本發明的咔唑生物堿類的作用特征是：或者通過抑制癌細胞的細胞周期周轉，或通過誘導癌細胞發生凋亡，或者通過直接殺傷癌細胞發揮作用，上述咔唑生物堿類活性化合物也可作為生命科學的研究試劑～細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑用于探索生命現象。

實施例1分離制備1．藥材的提取及活性部位的制備

黑果黃皮莖皮的干燥碎塊5公斤每次用70％的乙醇15L回流浸提，共提取三次，每次4小時。合并提取液，減壓濃縮，得粗浸膏300克。

將該浸膏用2500ml水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，分別收集各萃取液并濃縮。分別得石油醚提取物25克、氯仿提取物30克、乙酸乙酯提取物35克、正丁醇提取物60克和水溶部分150克。2．石油醚提取物中活性成分的追蹤分離

取石油醚提取物25克，用30克硅膠G拌樣，上減壓柱(250克硅膠H干法裝柱)層析，用石油醚(PE)-乙酸乙酯(EA)梯度洗脫分段，按極性粗分為20個流份，經活性測試及薄層檢測后合并，得到6個組分：A組分1.5g(PE洗脫)，B組分6.35g[PE-EA(99∶1～97∶3)洗脫]，C組分6.25g[PE-EA(96∶4～95∶5)洗脫]，D組分1.25g[PE-EA(95∶5～93∶7)洗脫]，E組分0.35g[PE-EA(93∶7～92∶8)洗脫]，F組分9g[PE-EA(90∶10～50∶50)洗脫]。其中B、C組分活性以誘導凋亡和細胞毒為主，D、E組份活性以細胞周期抑制為主，A和F組分無活性。

B、C組分用硅膠G(1∶50)上常壓柱，正已烷/丙酮95∶5洗脫，得到化合物7和8粗品5g和4.0g。