[發明專利]一種甲狀旁腺激素類似物及其重組制備

無效

• 申請號: 01102914.5
• 申請日: 2001-01-19
• 公開（公告）號: CN1365984A
• 公開（公告）日: 2002-08-28
• 發明（設計）人: 范開;黃洪濤;田峰;馬素永;聶李亞
• 申請（專利權）人: 重慶富進生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C12N15/63;A61K38/29;A61P5/18;A61P19/10
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本專利涉及一種甲狀旁腺激素類似物的蛋白質氨基酸序列、重組制備以及用途。

甲狀旁腺激素(Parathyroid?hormone，PTH)是體內最重要的調鈣激素，通過骨骼、腎臟和小腸三個主要靶器官調節血鈣平衡，直接或間接影響鈣離子在細胞內外及細胞器與胞漿之間的流動，從而發揮鈣在各種細胞功能和代謝活動中的重要作用。近年來發現PTH具有成骨作用，尤其在動物實驗和臨床研究中發現PTH可有效恢復骨質疏松患者所失去的無機骨質。

PTH在體內最初合成時，是一個含115個氨基酸的前體前甲狀旁腺激素原(PreproPTH)，其N末端25個氨基酸的引導肽(Pre部分)在內質網中被立即水解，形成90個氨基酸的無活性激素原(ProPTH)，后者又在高爾基體內切去N端6肽(Pro部分)，最終形成成熟的PTH。成熟的PTH為含84個氨基酸的單股多肽鏈，分子量9600道爾頓。在低鈣條件下，PTH從甲狀旁腺釋放。血中的PTH主要以三種形式存在：完整PTH(iPTH)、N端1-34肽段[PTH(1-34)]及C端56-84肽段(cPTH)。iPTH和PTH(1-34)均有通過骨骼和腎臟等靶器官調節機體血鈣濃度的完全生物活性，主要受體結合位點在N端1-6肽段，切除后會導致全部活性的喪失。cPTH占循環PTH的80％左右，半衰期較長，但沒有生物活性。

構效關系研究表明，PTH(1-34)包含了在各種測定系統中表現全部生物活性的所有必需結構，N端氨基酸為活性所必需，將其去除后PTH的生物活性明顯下降甚至完全喪失。如3-34肽段雖不表現活性，但含有與受體結合的必要結構并攜帶由代謝酶所識別的信息。同時，由于PTH(1-34)較短，體內代謝較iPTH快，符合天然激素作用特性。因此，PTH(1-34)在一定程度上可以完全取代iPTH而成為醫用甲狀旁腺激素的選擇

PTH在醫藥市場上有巨大的價值，用于治療多種原因引起的骨質疏松及甲狀旁腺功能減少等疾病。美國的NPS公司用大腸桿菌表達并生產的iPTH[即PTH(1-84)]已經進入三期臨床試驗，其結果證明了該藥明確的安全性和有效性。國內外已有多家研制單位應用大腸桿菌系統開發PTH(1-34)，以美國、日本和英國為主的臨床研究結果表明，PTH(1-34)在治療骨質疏松和甲狀旁腺機能減退癥療效方面顯示出與iPTH同樣的作用。

由于PTH(1-34)為短肽類激素，未見用酵母體系進行重組制備的相關文獻報道，目前的研制單位均用大腸桿菌融合表達體系進行。融合表達的重組蛋白必須經過相應的蛋白酶酶切后才能得到目的蛋白。文獻中用于大腸桿菌融合表達PTH(1-34)的蛋白酶主要有Thrombin、Factor?Xa、KEX2、DDP等，通過一定特異性識別位點進行有效的酶切而獲得重組PTH(1-34)，但在其N末端不可避免地留下1到2個多余的氨基酸，從而造成結構的變化和生物活性的下降。由于基因工程產品的特點，特別是在進行融合表達目的蛋白時，需要考慮融合蛋白的特性、工程菌對融合蛋白的適應能力、最后純化時所選擇蛋白酶的可能范圍以及蛋白酶酶切后對目的蛋白氨基酸序列的影響等。本發明的目的在于建立一種氨基酸數量和結構、生物活性和產率穩定的重組PTH類似物制備方法。通過對氨基酸的序列和結構分析，對PTH(1-34)N末端第1位氨基酸Ser進行包括Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Thr在內的中性氨基酸同源替代，第26位替代成Gln、Asn，使其在工程菌中的穩定性和產量得到明顯的提高，同時在選用特殊的融合表達體系時更有利于操作控制。