[發(fā)明專利]一種均相特異性檢測核酸的探針及應(yīng)用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01101446.6
• 申請日: 2001-01-13
• 公開（公告）號: CN1348096A
• 公開（公告）日: 2002-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 欒國彥;李慶閣;梁基選
• 申請（專利權(quán)）人: 欒國彥;李慶閣;梁基選
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/52;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門原創(chuàng)專利事務(wù)所
• 代理人: 張松亭

本發(fā)明涉及一種均相特異性檢測核酸的探針。

用探針特異性檢測核酸一般都需要將未雜交的探針分離出來，而均相檢測方法則不須分離步驟，具有反應(yīng)速率快，操作簡單，容易定量等突出優(yōu)點。如：Molecular?beacons技術(shù)。

均相核酸檢測近幾年在核酸擴增中應(yīng)用廣泛。如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，這是一種80年代后期發(fā)展起來的一種體外擴增核酸片段的技術(shù)，可在數(shù)小時內(nèi)使特定的核酸片段擴增至幾百萬倍。該項技術(shù)自發(fā)明以來已廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域。早期的PCR是通過電泳來檢測結(jié)果，其操作繁瑣，不能進行實時監(jiān)測。實時熒光PCR是近幾年發(fā)展起來的新檢測技術(shù)，具有諸多優(yōu)點，尤其在臨床診斷中優(yōu)勢明顯。由于采用閉管測定方式，消除了傳統(tǒng)凝膠電泳或其它非均相方法的擴增產(chǎn)物污染的隱患，從而在測定步驟中杜絕了假陽性的主要來源。并且通過實時動態(tài)監(jiān)測可以獲得準確的原始模板定量，動態(tài)范圍也較終點測定方式大大加寬。同時熒光測定在分析靈敏度、簡便性等方面都具有明顯優(yōu)勢。

目前實時熒光PCR檢測技術(shù)已有多種方式，可以分為非探針型和探針型兩類。非探針型有熒光嵌入劑法、Sunrise?Primer(又稱Amplifluor)、AmpliSensor等；探針型包括：5’—核酸外切酶技術(shù)(TaqMan探針)、分子信標(molecularbeacon)技術(shù)、應(yīng)用于Lightcycler的雙探針技術(shù)、蝎子引物(Scorpions?primer)等。前者由于無法識別非特異擴增產(chǎn)物，在實際應(yīng)用中受到很大限制。后一種類型，由于增加了探針識別步驟，提高了測定的可靠性，但普遍存在實驗設(shè)計復(fù)雜，價格高昂等缺點，并且有些方法識別單堿基突變的能力不強。

本發(fā)明設(shè)計的熒光雙鏈探針，可以均相特異性檢測核酸，要求的實驗設(shè)計簡單，可操作性強。在保證特異性和靈敏度的同時，實現(xiàn)對核酸的測定。

熒光雙鏈探針的構(gòu)成

熒光雙鏈探針是一對(兩條)按照脫氧核糖核酸(DNA)堿基互補配對原則而反向互補的寡核苷酸，兩條鏈長度不同。因為兩條鏈不等長，所以從整體上看探針可以分為兩部分，一是單鏈的觸手區(qū)，一是雙鏈區(qū)。這種探針我們稱為“觸手探針”。在其中的一條寡核苷酸上標記熒光供體，在另一條寡核苷酸上標記熒光受體或淬滅劑。并且探針序列與靶序列互補，可以發(fā)生雜交反應(yīng)。熒光雙鏈探針在不同的條件下可以形成多種形態(tài)，并且伴隨熒光強度的改變。探針兩條鏈在穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，淬滅劑靠近熒光劑，熒光劑的熒光被淬滅，此時探針沒有熒光；在酸、堿、熱等條件下探針分開成兩條單鏈，淬滅劑遠離熒光劑，熒光劑發(fā)出熒光；當恢復(fù)至溫和條件，兩條鏈復(fù)性為雙鏈狀態(tài)，淬滅劑靠近熒光劑，探針沒有熒光；當有靶序列存在時，探針的兩條鏈分別與各自互補的靶序列雜交，兩條鏈因此而分開，淬滅劑遠離熒光劑，熒光劑發(fā)出熒光。探針的應(yīng)用主要有以下兩方面：

“觸手探針”與靶序列自發(fā)地發(fā)生置換式雜交反應(yīng)：

“觸手探針”可以與溶液中的單鏈靶序列發(fā)生置換式雜交反應(yīng)，探針的“觸手”是單鏈的，它會首先與溶液中的單鏈靶序列碰撞結(jié)合，然后靶序列將置換短鏈與長鏈形成更穩(wěn)定的靶序列和長鏈的雜交體，此時探針的長鏈和短鏈分離，熒光劑遠離淬滅劑，探針發(fā)出熒光。見圖1。

用“觸手探針”PCR反應(yīng)的實時監(jiān)測：

所述的熒光雙鏈探針在進行PCR檢測中，兩條寡核苷酸的3’端必須進行封閉，使其不能作為引物延伸。

在由熒光雙鏈探針存在的PCR反應(yīng)混合體系中，進入熱變性階段，“觸手探針”和模板均發(fā)生變性，熒光劑遠離淬滅劑，熒光性質(zhì)得以恢復(fù)。

溫度降低至退火溫度時，如果沒有靶序列的存在，兩條探針將恢復(fù)至雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光劑與淬滅劑靠近，熒光劑被淬滅；如果有靶序列的存在，兩條探針將分別與靶序列雜交，使兩條探針無法恢復(fù)至雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光劑遠離淬滅劑，熒光劑發(fā)出熒光。

在PCR的延伸階段，因為高溫兩條探針從靶序列上解離，使延伸反應(yīng)順利進行。然后進入下一個循環(huán)。

由以上過程可見，我們可以通過實時熒光PCR儀在PCR反應(yīng)的復(fù)性階段檢測熒光的變化，從而動態(tài)監(jiān)測靶序列的有無及含量。見圖2。

熒光雙鏈探針的設(shè)計方法：

1.兩條鏈的長度：兩條鏈一般不等長，探針的堿基互補配對使其呈雙鏈結(jié)構(gòu)，長出的“觸手”長度最好在2-10核苷酸之間。

2.熒光劑和淬滅劑的標記位置：熒光劑和淬滅劑可以標記在探針的頂端也可標記在探針的中間，但最好標記在同一對互補的堿基上，這樣熒光劑和淬滅劑的位置很近，可以達到最大的淬滅效率。