[發明專利]用于生產核黃素的單細胞生物體或多細胞生物體

無效

• 申請號: 00811424.2
• 申請日: 2000-07-31
• 公開（公告）號: CN1369013A
• 公開（公告）日: 2002-09-11
• 發明（設計）人: H·阿爾特菲;O·策爾德;J·L·雷維爾塔多瓦爾;M·A·桑托斯加西亞;H·薩姆;K·－P·施塔曼;I·梅廷
• 申請（專利權）人: BASF公司;于利奇研究中心有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/80;C12N9/04;C12N1/15;C12P25/00;//;C12R1645)
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 羅宏,邰紅

本發明涉及產生核黃素的單細胞生物體或多細胞生物體。

維生素B2，也叫做核黃素，對人和動物來說是必不可少的。維生素缺乏可造成口和咽黏膜發炎、嘴角撕裂、皮褶瘙癢和發炎以及其他的皮膚損傷、結膜、視力下降、角膜渾濁等疾病。在嬰兒和兒童中會造成體重停止增加和體重下降。因此，維生素B2是具有其經濟重要性，尤其是其用做治療與維生素缺乏相關的維生素藥劑和作為食品添加劑。此外，它也可用作食品染料，例如用在蛋黃醬、冰激凌、布丁中。

核黃素可通過化學法和微生物學方法來生產。在化學生產方法中，核黃素通常是以多步方法的純終產物的形式得到的，然而這必須使用相對較為昂貴的出發物質，如D-核糖。

利用微生物體來生產核黃素為利用化學法生產這種物質提供了一種替代方法。利用微生物法生產核黃素尤其是可用于沒有對核黃素做高純度要求的情況。這些情況有例如核黃素用做動物飼料產品添加劑。在這些情況下，微生物法生產核黃素具有可通過一步法來獲得的優點。這種方法也可能利用可再生原材料，如植物油原料來進行微生物合成。

已經有關于利用真菌如棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya?gossypii)或Eremothecium?ashbyi發酵來生產核黃素的公開內容(The?MerckIndex，Windholz?et?al.，eds.Merck&Co.，page?1183，1983，A.Bacher，F.Lingens，Augen.Chem.1969，p.393)；然而，酵母如假絲酵母或釀酒酵母、以及細菌如梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌和棒狀桿菌也適于核黃素的生產。

此外，已經有對通過酵母著名念珠菌(Candida?famata)來生產核黃素的方法的描述，如專利US05231007。

已經有對核黃素超量生產菌株的描述，如在專利EP405307，其中的菌株是通過轉化枯草芽孢桿菌的核黃素生物合成基因來獲得的。然而，這些原核基因是不適于通過真核生物如釀酒酵母或棉桃阿舒氏囊霉經由重組方法來生產核黃素的。鑒于這個原因，按照專利WO93/03183的方法，從一種真核生物即釀酒酵母中將特異的核黃素生物合成基因分離出來，目的是利用它們在真核的核黃素產生生物體中尋找一種重組方法來生產核黃素。然而，如果不能為核黃素生物合成中特異的酶提供充足的底物，在核黃素生產中，這樣的重組生產方法是不成功的，或者是僅僅取得有限的成功。

1967年，Hanson發現(Hansom?AM，1967，in?MicrobialTechnology，Peppler，HJ，pp.222-250?New?York)在利用棉桃阿舒氏囊霉生產核黃素時添加甘氨酸可增加核黃素的形成。然而，這樣的方法是不利的，因為甘氨酸是一種很昂貴的原料。鑒于這種原因，我們努力通過制備突變體來優化核黃素的生產。

專利DE19545468.5A1中公開了另外一種通過微生物法生產核黃素的方法，在這種方法中，核黃素生產微生物中的異檸檬酸裂解酶基因的表達和異檸檬酸裂解酶活力都得到了提高。此外，專利DE19840709?A1公開了通過生物技術方法利用單細胞生物或多細胞生物，尤其是微生物來生產核黃素的方法。這些生物體的區別就在于其體內的甘氨酸代謝水平至少與野生種棉桃阿舒氏囊霉ATCC10892相同，而前者是經過改造使其具有不需要任何的外部甘氨酸供應就能合成核黃素的能力。

然而，即使與這些方法相比，仍然需要進一步的優化核黃素生產。

按照本發明的目標，我們需要得到單細胞或多細胞生物，優選微生物，來進行核黃素的生物技術法生產，而這些生物可使得進一步優化核黃素的形成成為可能。尤其是，有必要找到一株生物體，利用它就可獲得比本領域中現今的核黃素生產更加經濟的生產方法。最重要的，這些微生物應該有可能使得核黃素的產量要比利用現有微生物獲得的產量高。

我們已經發現，通過一種單細胞或多細胞生物我們就可實現這種目標，這些生物中與NAD(P)H形成相關的酶的活力較野生種棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895中這種酶的活力要高。