[發明專利]用于提高蛋白質穩定性和產量的方法以及可用于生產這種穩定蛋白質的細胞系

無效

• 申請號: 00809670.8
• 申請日: 2000-05-18
• 公開（公告）號: CN1359388A
• 公開（公告）日: 2002-07-17
• 發明（設計）人: H·C·迪斯;J·斯莫里克
• 申請（專利權）人: 福托金公司
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C12P21/06;C12P21/04;C12P19/34;H01J29/10;H01J5/50;H01J5/48
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 樊衛民

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本申請要求相同發明人于1999年5月28日提交的、共同未決的美國臨時申請流水號60/136,676的利益。

本發明涉及功能性生物學物質的生產及穩定，諸如蛋白質、病毒劑、或其它生物學劑或產物，包括，但不限于，酶、激素、生長因子、結構蛋白、腫瘤抑制劑、核酸和核酸探針、疫苗、抗原、抗生素、脂質、簡單和復合的碳水化合物、醇類及其它溶劑、和這些方法的產品。這些功能性生物學物質可用于例如制造疫苗和診斷性測定法或測試。

然而，可用于制造諸如疫苗和診斷性測定法等產品的病毒、病毒抗原、和其它病毒產物的生產是昂貴的，耗時的，還需要高水平的專門技術。病毒必須在活的真核細胞中增殖。能被一種特定病毒感染的真核細胞稱為對該病毒是“許可性的”。但是，大多數真核細胞不是對任何給定病毒都是許可性的，而且沒有預測許可性的技術。另外，對病毒生產允許的細胞可能具有不同水平的許可性。有些細胞系可產生大量病毒，而其它細胞系可能只允許低水平的病毒復制。因此，為了確定用于病毒生產的最佳細胞，必須對許多細胞系進行經驗研究，這種研究有時是大型的，通常是耗時的。更為復雜的是，最佳細胞系可能不是來自獲得病毒的宿主(如病毒影響的患者的人細胞)。來自特定宿主的病毒常常沒有合適的細胞系。

因為其穩定性、永生性、已知特征、和通過長期經驗確定的行為，細胞系優選來自宿主的原代細胞培養物。在病毒生產中使用這些細胞系的需求已導致用于生產各種病毒的大量外來細胞系的開發。例如，犬瘟熱病毒(CDV)、麻疹病毒在Vero細胞(即非洲綠猴腎細胞)中生長得很好，但在狗細胞中則不增殖；而牛白血病病毒(BLV)則由衍生自蝙蝠肺組織的細胞系生產。

不幸的是，病毒在與通常感染的宿主和組織相差甚遠的細胞系中的生長可引起這些病毒以遠離其正常行為的方式發生作用。

此外，病毒的復雜病理學可使病毒的制造極其困難。例如，CDV和人皰疹病毒(HMV)是密切相關的病毒。在感染它們各自的犬和人宿主時，這兩種病毒作用相似，都產生腦炎和長期后遺癥，其中中樞神經系統遭到損傷或破壞。在最初感染CDV多年后在狗中發生的中樞神經系統疾病稱為老狗腦炎(ODE)。在人中，相應的狀況是亞急性硬化性全腦炎(SSPE)。ODE和SSPE的病因與疾病的腦炎期中產生的病毒體和受影響的細胞的數目直接相關。這繼而與腦細胞對病毒的許可性和宿主免疫系統對病毒的快速應答能力直接相關。腦病毒滴度達到異常高水平的狗或人在多年后可形成這些長期后果。事實上，在有些感染患者中的高病毒滴度可導致在腦細胞中永久生成病毒蛋白質，甚至在感染已被清除后。即使已多年未生成有活力的病毒，免疫系統仍將病毒蛋白質識別為外來的并繼續攻擊它。最終，宿主免疫系統與這些異常細胞之間的戰斗造成足以破壞宿主認知能力的損傷。通常對患有ODE的狗施以安樂死。人患上SSPE的后果是進行性癡呆，最終死亡。由于這種復雜的病理生理學原因，制造的病毒和病毒產物在體內刺激免疫力的應用中未獲成功。

既然許多病毒(諸如CDV和HMV)感染腦細胞，那么腦細胞系的許可性在產生的疾病之病理生理學研究中和在診斷劑和正確模擬自然感染過程中病毒特征的疫苗之生產中具有重要作用。然而，很少存在神經細胞系，而且它們只產生低水平的CDV或HMV。因此，這些細胞系產生的病毒水平不足以供應研究，而且尤其不適用于抗原或疫苗生產。因而需要修飾這些細胞或細胞系以支持高水平的病毒復制和病毒產物的方法以及細胞系自身。

除了與生產有用滴度的已知病毒有關的問題外，尋找未知病毒是極其困難的，因為未知病毒復制所需的細胞類型其自身也是未知的。例如，存在可能由未發現的病毒劑所引起的大量中樞神經系統疾病?？搜挪?Creutzfield-Jacob?Disease，CJD，影響人)、瘙癢病(影響羊)、和牛海綿狀腦病(影響牛)這些退化性疾病都是非常慢的神經退化性疾病，其病因仍然未知。直至今日，仍未鑒定出引起這些疾病的物質，也未由感染的人或動物腦組織繁殖出任何病毒劑。這促進了關于疾病病因的多種非正統假定，包括提出某種特定蛋白質(稱為“朊病毒”，有人提出它是無需任何遺傳物質而能夠引起感染并繁殖的因子)可能作為感染性因子。然而，沒有哪種(甚至高水平)產生朊病毒的細胞系顯示具有感染性。經修飾產生朊病毒的轉基因小鼠不具有感染性，即使當它們呈現疾病的診斷性特點時。因此，沒有用于鑒定感染性因子的方法，就不能產生用于這些疾病的好的診斷測試，而且疫苗生產也是不可能的。