[發明專利]物質的電泳輔助染色

無效

• 申請號: 00808751.2
• 申請日: 2000-06-08
• 公開（公告）號: CN1363006A
• 公開（公告）日: 2002-08-07
• 發明（設計）人: R·L·凱爾施曼;R·奧多姆;T·庫瓦哈拉;M·雷丁頓
• 申請（專利權）人: 分析科學公司
• 主分類號: D06P5/20
• 分類號: D06P5/20;G01N27/36;G01N27/447
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 羅宏,姜建成

發明背景

本發明涉及對生物樣品成像的染色。

用于透射顯微鏡，包括可見光顯微鏡和電子顯微鏡成像的器官組織樣品和其他物質樣品，通常是通過對樣品進行一系列的化學處理，最后形成包埋樣品的實心塊。

在一種傳統的組織樣品制備過程中，首先將組織通過福爾馬林、戊二醛或其他物質進行化學固定，這些物質可保護樣品免予自我分解(自我降解)，可賦予樣品剛性，增加樣品的滲透性，從而提高了隨后的溶液滲透。緊接固定步驟的是滲透這一步，這一步通過逐漸增加溶劑如乙醇和二甲苯的濃度來逐步替代其中的水，最后將其全部去除掉。緊接滲透的是石蠟包埋，然后將樣品冷卻到室溫，使其凝固。另一種方法，組織可以用塑料多聚體來滲透，然后通過加熱、紫外線或其他方式來使起變硬。隨后將此堅硬的、滲透過的組織塊安置在一個模子中，以石蠟或塑料來包被以產生組織塊。

在組織切片機上對包含有組織的樣品塊進行切片。對于使用光學顯微鏡來講，要將切片收集后放于載玻片上。切片在載玻片上固定好后就要利用能夠標記特異細胞部位(如核酸、脂質等)的多種染料進行染色，或者進行免疫組織化學處理。

另外還有en?boc染色法，其中整個樣品是通過浸沒染色，這一步是在以形成組織塊的滲透和包埋之前進行的。然后進行組織切片進行透射顯微鏡成像，或者組織塊本身的切割面可通過一種叫做組織塊表面顯微鏡方法的加工過程進行成像。后一種情況包括了使用Surface?Imaging?Microscope(U.S.專利號4,960,330，″ImageRecording?Apparatus″)，其中樣品是經過en?boc染色后利用非常不透明的介質進行滲透和包被，或者通過其他處理方法，這樣就就防止了在組織塊幾微米深處產生的組織成像。通過這樣操作就制備了一種與在傳統的載玻片上固定發組織切片非常相似的薄的、‘實質’切片(virtual?section)。

因為在組織塊表面顯微鏡技術中成像的物質的體積是與傳統的基于載玻片的技術中更加薄的物質切片相對較大，因而en?boc染色就要對更厚的物質進行滲透。這種情況令人不快的延長了樣品的制備時間。

在en?boc染色中，可用于加速染色劑滲透如組織的方法包括合適的固定劑選擇；應用加熱、微波輻射、真空或超聲波；以及向染色液中添加去污劑或其他化學品。然而，即使應用這些方法，染色劑滲透入體積相對較大的組織中也需要以天甚至周來計的時間。當染色劑分子或染色劑前體與大載體分子，如免疫組織化學操作中的用到的載體，相結合時，滲透時間就會更長。

發明概述

一般來講，本發明特征在于通過應用電泳技術，來提高生物樣品染色所用到的染色劑組分的滲透速度和滲透程度。電泳技術是指在電場的作用下帶電分子在流體中移動的一種方法。染色過程中用到的染色劑或其各個組分包括自由染料(free?dye)或著色劑分子、抗體的化學綴合物，核酸探針和其他高分子量載體分子，如抗體。

本發明的特征在于一種可對生物樣品進行en?boc染色的方法，包括以下步驟：(a)將樣品浸入染色液中，這種染色液含有一種離子導電溶液(ionically?conductive?solution)以及一種與樣品組分相結合的染色劑前體或帶電染色劑分子，以及(b)施加穿越染色液的電場使染色劑分子滲透過樣品。提高了染色劑對樣品的滲透作用。

本發明的方法的另一特征包括：(c)將含有第一抗體的樣品浸沒到染色溶液中，這種溶液含有離子導電溶液和可與第一抗體進行結合并且帶有電荷的第二抗體；以及(d)施加穿越染色液的電場使染色劑分子滲透過樣品。提高了第二抗體對組織的滲透作用。

在本發明的另一種優選實施方案中，含有第一抗體的樣品是浸沒在含有可結合到第一抗體上的第二抗體的溶液中。

在本發明的一種優選實施方案中，在將樣品浸沒到染色溶液中之前是將樣品用凝膠支持物進行滲透作用。

在本發明的一種優選實施方案中，施加的電壓為50-700V，優選的是100-400V。維持電場的時間為1-25小時，優選的是3-15小時。

在本發明的另一種優選實施方案中，染色液包括染色劑前體和染色劑分子，或第一抗體與第二抗體，此處所選的分子對可在電場中以相反方向運動。將一種組分，如染色劑前在樣品的第一面加入染色液中，第二種組分，例如染色劑分子在樣品的另一面加入染色液中。