[發(fā)明專利]構(gòu)建DNA文庫的方法和其上固定有DNA文庫的支持物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00808415.7
• 申請日: 2000-05-10
• 公開（公告）號: CN1353752A
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高橋浩二郎;高井修;丹花通文
• 申請（專利權(quán)）人: 東洋鋼板株式會社;日本帕克里津廣島株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12Q1/68;C12M1/34
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 唐偉杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的工業(yè)領(lǐng)域涉及基因技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)和生物化學(xué)技術(shù)，具體地涉及通過利用微量DNA實驗材料構(gòu)建其上固定有脫氧核糖核酸(以下稱“DNA”)的原始支持物的方法，構(gòu)建其復(fù)制支持物的方法和固定有DNA片段的支持物。

發(fā)明背景

在傳統(tǒng)技術(shù)中，當(dāng)對DNA進(jìn)行實驗時，由于DNA是極為重要的實驗材料，故通過利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下稱“PCR”)擴(kuò)增DNA，并將其分成小份。此DNA實驗材料在冷凍設(shè)備中保存在極低的溫度下。在傳統(tǒng)技術(shù)中，DNA文庫是在溶液條件下制備的，以致不能制備該DNA文庫的復(fù)制物。因此，必須在溶液條件下極為小心地處理從微量組織或細(xì)胞獲得的DNA文庫實驗材料，以便對其基因進(jìn)行研究和診斷。本發(fā)明的目的是提供通過利用微量DNA文庫實驗材料構(gòu)建其上固定有DNA文庫的DNA文庫支持物(原始支持物)的方法。本發(fā)明的另一目的是提供構(gòu)建必要數(shù)量的復(fù)制支持物的方法。

而且，本發(fā)明的另一目的是提供其上固定有復(fù)制DNA片段的支持物。

發(fā)明公開

在根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建cDNA(互補(bǔ)DNA)文庫的方法中，該方法的特征在于將支持物上的oligo(dT)n與mRNA(信使核糖核酸，以下稱“mRNA”)雜交，并通過RT(逆轉(zhuǎn)錄酶，以下稱“RT”)作用以固定互補(bǔ)DNA。

在根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建cDNA文庫的方法中，mRNA與固定在支持物上的cDNA文庫解雜交(dehybridize)。該方法的特征在于通過利用該解雜交的mRNA固定相同的cDNA文庫。

在根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建gDNA(基因組DNA)文庫的方法中，該方法的特征在于將雙鏈gDNA與支持物上具有限制性酶位點的寡核苷酸連接在一起。

在根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建單鏈gDNA文庫的方法中，該方法的特征在于利用權(quán)利要求3所述的支持物上固定的gDNA的有義部分。

在根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建單鏈gDNA文庫的方法中，該方法的特征在于使權(quán)利要求3所述gDNA文庫的反義部分解雜交，并利用該反義部分通過合成在支持物上固定有義部分。

在權(quán)利要求1-5之一所述的根據(jù)本發(fā)明的任何方法中，其特征在于支持物預(yù)先經(jīng)核苷酸或寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾。

根據(jù)本發(fā)明的支持物的特征在于通過權(quán)利要求1-6之一所述的任何方法固定有DNA文庫。

根據(jù)本發(fā)明的支持物的特征在于固定的是單鏈DNA文庫。

附圖簡述

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建cDNA文庫支持物的裝置的示意圖。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建gDNA文庫的裝置的示意圖。圖3顯示用于解釋根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建cDNA文庫支持物的方法的流程圖。圖4顯示用于解釋根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建cDNA文庫支持物的方法的示意圖。圖5是用于解釋根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建gDNA文庫支持物的方法的流程圖。圖6是用于顯示根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建gDNA文庫支持物的方法的示意圖。圖7顯示支持物f的放大圖。圖8顯示支持物e的放大圖。

實施本發(fā)明的最佳方式

預(yù)備僅經(jīng)過核苷酸或寡核苷酸化學(xué)修飾的原始支持物和大量用于復(fù)制用途的支持物，以便制備原始支持物或復(fù)制支持物。將這些支持物放入構(gòu)建復(fù)制物的裝置中。我們將參照附圖對用于根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建DNA文庫支持物的裝置進(jìn)行說明。圖1是構(gòu)建cDNA文庫支持物的裝置的示意圖。圖2是構(gòu)建gDNA文庫支持物的裝置的示意圖。圖3是解釋cDNA文庫支持物的構(gòu)建方法的流程圖。圖5是解釋gDNA文庫支持物的流程圖。

圖1顯示了自動構(gòu)建和復(fù)制cDNA文庫支持物的裝置的示意圖。圖1所示用于構(gòu)建DNA文庫支持物的裝置A含有用于向容器中輸送反應(yīng)溶液的送液器105、用于停止該反應(yīng)溶液和輸送新反應(yīng)溶液的送液開關(guān)器220、用于在平面的前后左右方向和上下方向驅(qū)動用于注入/排出實驗材料的噴管101的噴管驅(qū)動器100、用于加熱/冷卻前述容器中的反應(yīng)溶液的溶液溫度控制器30、用于容納裝有用來構(gòu)建相應(yīng)固定化DNA文庫支持物的各實驗材料和/或溶液的容器的實驗材料容器支撐器20、和用于將該實驗材料容器支撐器控制在預(yù)定溫度的實驗材料容器溫度控制器40，等。優(yōu)選地，鑒于將來與PCR裝置和/或PCR產(chǎn)物分析裝置的連接，容器支撐器10能夠容納96個或更多個實驗材料容器。優(yōu)選地，為了構(gòu)建復(fù)制支持物，實驗材料容器支撐器20含有至少4個實驗材料容器插入孔。優(yōu)選地，鑒于將來與PCR裝置和/或PCR產(chǎn)物分析裝置的連接，實驗材料容器支撐器20上提供的容器插入孔數(shù)目為10個孔或更多個孔。優(yōu)選地，鑒于溶液溫度控制器30和實驗材料容器溫度控制器40的溫度控制，容器支撐器10和實驗材料容器支撐器20為具有良好導(dǎo)熱性的鋁塊。