[發(fā)明專利]用于多肽的表達(dá)和分泌的果膠酸裂解酶融合體

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 00808288.X
• 申請(qǐng)日: 2000-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN1353762A
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邁克爾·D·拉斯馬森;馬茲·E·比約恩瓦德;伊凡·迪爾斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 諾維信公司
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/75;C07K19/00;//C12N9/26C07K14/605C07K14/62
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所
• 代理人: 巫肖南,黃益芬

1.一種細(xì)胞，其包含一種能編碼依次融合在一個(gè)開放讀碼框內(nèi)的至少以下元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽。

2.一種細(xì)胞，其包含一種能編碼依次融合在一個(gè)開放讀碼框內(nèi)的至少以下元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，含至少2個(gè)氨基酸的接頭，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽。

3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為革蘭氏陽性微生物細(xì)胞。

4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為芽孢桿菌細(xì)胞。

5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自地衣芽孢桿菌、Bacillus?clausii、短芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、和Bacillus?agaradhaerens。

6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是由蛋白酶識(shí)別并切割的氨基酸序列。

7.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是氨基酸序列Lys-Arg(KR)。

8.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)。

9.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是當(dāng)所融合的多肽被所述細(xì)胞分泌時(shí)被切割的氨基酸序列。

10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是能被化學(xué)化合物切割的氨基酸序列。

11.權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中所述化學(xué)化合物是溴化氰或羥胺。

12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述果膠酸裂解酶選自以下果膠酸裂解酶，這些酶含有選自SEQ?ID?2、SEQ?ID?4、SEQ?ID?6、SEQ?ID?8、和SEQID?10的氨基酸序列。

13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述果膠酸裂解酶是一種同系物，其與含有選自SEQ?ID?2、SEQ?ID?4、SEQ?ID?6、SEQ?ID?8、和SEQ?ID10的氨基酸序列的果膠酸裂解酶具有70％的氨基酸序列相似性。

14.權(quán)利要求2-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中出現(xiàn)在接頭中的氨基酸殘基至少25％為脯氨酸。

15.權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述接頭依次包含氨基酸的至少一個(gè)循環(huán)重復(fù)：Pro-Glu-Pro-Thr，Glu-Pro-Thr-Pro，Pro-Thr-Pro-Glu，或Th-Pro-Glu-Pro(PEPT，EPTP，PTEP，或TPEP)。

16.權(quán)利要求2-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述接頭包含氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)的至少一個(gè)重復(fù)。

17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽選自激素，功能型激素類似物，酶和人工多肽。

18.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽為包含SEQ?ID12中350-834位所示氨基酸序列的α-淀粉酶。

19.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽為包含SEQ?ID14中348-378位或SEQ?ID?16中356-386位所示氨基酸序列的人類GLP-1(7-37)激素類似物。

20.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽為包含SEQ?ID18中所示氨基酸序列的單鏈人類胰島素(MI3)。

21.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽包含含有SEQID?20中356-408位所示氨基酸序列的單鏈人類胰島素(MI3)。