[發明專利]植物轉化方法

無效

• 申請號: 00806271.4
• 申請日: 2000-04-19
• 公開（公告）號: CN1347457A
• 公開（公告）日: 2002-05-01
• 發明（設計）人: T·里薩奇;M·格雷茲
• 申請（專利權）人: 羅拜奧公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 余穎

本發明提供一種以農桿菌介導轉化植物尤其是轉化單子葉植物的方法。

本發明涉及植物轉化，尤其是谷類的轉化，具體地說，涉及根癌農桿菌或其它農桿菌(在此都稱為“農桿菌”)的用途。至今，只能用直接轉化法來生成轉基因谷類植物。為此，最普遍認可的是粒子槍轟擊法。最近，有報道稱，某些谷類可用農桿菌進行基因改造(Hiei等，植物分子生物學(1997)35：205-218)；Ishida等，自然生物技術(1996)14：745-750；Cheng等，植物生理學(1997)115：971-980；Tingay等，植物雜志11：1369-1376(1997))。

文獻中報道的轉化率對不同的谷類變化很大。典型的如高度依賴于基因型的玉米系統，其轉化率很低。對于稻米的轉化率據報道也較低，對小麥的轉化率尤其低。在以上系統中，都是將農桿菌體外用于正在去分化或已經去分化的分離組織。

如上所述，已經有了對用于稻米(Hiei，1997)，玉米(Ishida，1996)，小麥(Cheng，1997)和大麥(Tingay，1997)的農桿菌轉化系統的報道。這些方法的一項共同特征是從供體植株分離獲得外植體(以未成熟的胚或胚形成性愈傷組織為佳)，并用農桿菌體外接種。

Hess及其同事(植物科學72：233-244，1990)曾嘗試將農桿菌接種到小麥的小穗來轉化小麥。其目的是通過花粉的轉化來傳遞基因，然后通過正常授粉獲得轉化的種子。其中沒有或沒有提及從接種后的小穗分離出組織然后在培養基中篩選并再生。

另有報道通過苗端接種進行玉米和稻米的農桿菌轉化(Gould?J(1991)植物生理學95：426-434；Park?SH(1996)植物分子生物學32：1135-1158)。同樣，其目的仍是通過轉化繁殖細胞獲得轉化的種子。這種再生途徑不同于本發明方法：實際上，此類方法的一項特殊目的是避開所有經歷組織去分化和偶然性再生的植物再生方法。

美國專利5,177,010和5,187,073(Goldman等)描述了一種轉化玉米和禾本科的方法，包括造成新出籽苗創傷，用農桿菌接種。同樣，該方法的目的是轉化籽苗中的繁殖細胞，從而在天然植株中形成繁殖器官，并由此回收轉化的花粉。

另一種方法是試用農桿菌轉染法來轉化谷類。美國專利5,569,597(Grimsley等)描述了一種用農桿菌將病毒DNA導入植株的方法。將玉米斑紋病毒的DNA插入農桿菌的T-DNA，然后用此攜帶病毒DNA的農桿菌接種玉米的籽苗，如果出現疾病癥狀，則表明病毒在植物細胞內繁殖。因此，農桿菌在此作為將病毒DNA引入植物的載體，病毒可由此引起系統性感染。然而，沒有證據表明農桿菌轉染能獲得病毒DNA進入植物基因組的植物轉化。該專利的轉化仍以分生組織為目標，以獲得轉化的繁殖細胞為目的。

在本發明的新方法中，靶組織在其天然植株環境中被接種以農桿菌并共培養。如此，靶組織仍可按照正常的生理和時序途徑發育。然后，從其正常環境中分離出靶組織，由去分化和再生途徑形成轉基因植物。所示轉基因植物以能育的為佳。

本發明中，“處于其天然植株環境”包括靶組織能夠按照基本正常的生理和時序途徑發育的所有情形。這些情形包括靶組織處于體內，靶組織仍在植株之內、之上或與之相連(例如，靶組織是半裂分蘗上種子內的胚)，或靶組織仍處于與其在植株上時相同的細胞環境中(例如，靶組織是分離的種子或其部分中的胚)。其它例子包括仍在葉鞘內或至少仍與植株相連的未成熟花序，或仍在未開花蕾中的未成熟花藥。

去分化指細胞簇，例如愈傷組織表現出無序生長。

除靶組織處于與其在植株上時相當的環境之外，農桿菌也處于更似其天然環境的環境中。因此，農桿菌轉化靶組織的效率很可能高于現有技術在培養皿中所進行的。

以上兩因素的結果之一是將所需轉基因導入靶組織的轉化率更高，因此生成轉基因植物的轉化率也更高。

大多數轉化方法中的基本步驟之一是造成靶組織創傷。就農桿菌而言，這可能出于兩個理由：暴露出對轉化產生應答并能夠再生的細胞，(尤其對禾本植物來說)和誘導農桿菌傳遞其T-DNA。一種已公開的用于小麥的無創傷方法仍用到一種潤濕劑(Silwet或普盧蘭尼克酸)或真空抽濾(WO97/48814)。所有以上方法都不可避免地有組織損傷，并因而降低再生能力。

在本發明的優選實施方式中，靶組織內表現的創傷被保持在最低水平，或完全沒有一雖然可能用到潤濕劑，但這并不是必須的。在傳遞過程中可能出現組織的潛表損傷，但即使此時，作為農桿菌作用目標的大部分可再生細胞仍是完好的，其再生能力不受影響。