[發(fā)明專利]用于保存感染性重組腺病毒的組合物

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 00806090.8
• 申請(qǐng)日: 2000-04-07
• 公開（公告）號(hào): CN1347450A
• 公開（公告）日: 2002-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: F·布蘭奇;施香君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 阿文蒂斯藥物股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;A61K48/00
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 王杰

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及保存呈穩(wěn)定形式的可儲(chǔ)存腺病毒，以及用于這種保存的液體或凍凝組合物。

背景技術(shù)

保存穩(wěn)定組合物中的腺病毒是一個(gè)已知的問(wèn)題，該問(wèn)題已成為許多研究工作的課題，直到現(xiàn)在還未得到真正令人滿意的結(jié)果。事實(shí)上，這些重組病毒只是在達(dá)到在未發(fā)生降解以及沒(méi)有失去其感染能力之時(shí)將它們儲(chǔ)存的條件下才是可使用的。

溶液中腺病毒顆粒的物理狀態(tài)隨時(shí)間流逝同時(shí)而快速地發(fā)生兩種變化：一方面病毒顆粒聚集(凍凝)呈團(tuán)或絲狀，因?yàn)檫@種現(xiàn)象是不可逆的，所以是極嚴(yán)重的，而另一方面，衣殼本身的二十面體結(jié)構(gòu)分裂(通過(guò)衣殼溶胞作用，衣殼體釋放到介質(zhì)中)。

在國(guó)際申請(qǐng)WO?98/02522中，曾描述一種在含有蔗糖的水溶液中保存呈懸浮液形式的感染重組病毒的方法。推薦的組合物不含有甘油，按照優(yōu)選實(shí)施方式含有至少一種二價(jià)陽(yáng)離子鹽或一價(jià)堿金屬陽(yáng)離子鹽。

但是，可能表明蔗糖沒(méi)有系統(tǒng)地帶來(lái)在+4℃的穩(wěn)定作用，根據(jù)這種情況，在這個(gè)溫度下的穩(wěn)定作用從未超過(guò)2星期，或至多也短于2個(gè)月。

在《病毒學(xué)雜志》(J.Virology)，70(11)，7498-7509(1996)中，曾描述以三羥甲基氨基甲烷緩沖液和甘油為主要成分的緩沖液形式保存腺病毒，但該緩沖液系統(tǒng)地含有氯化鎂。這些制劑必需保存在非常低的溫度下，約-70℃，以免其感染能力降低。

在《人體基因治療》(Human?Gene?Therapy)，7，1693-99(1996)中，還使用一種以三羥甲基氨基甲烷緩沖液和甘油為主要成分的含有氯化鎂的儲(chǔ)存制劑。這個(gè)制劑保存在-80℃。

更一般地，直到今天在該文獻(xiàn)中描述的以三羥甲基氨基甲烷為主要成分的制劑系統(tǒng)地含有氯化鎂(一般1毫摩爾)或/和具有生理濃度的鹽(一般，150毫摩爾NaCl)。作為示例，例如可以列舉[《細(xì)胞》(Cell)，68，143-155(1992)；《自然遺傳學(xué)》(Nature?Genetics)，3，229-234(1993)；《人體基因治療》，6，5-11(1955)；《人體基因治療》，6，145-153(1995)；《人體基因治療》，6，277-287(1995)；《人體基因治療》，6，643-666(1995)；《人體基因治療》，6，1039-1044(1995)；《人體基因治療》，6，1317-1322(1995)；《人體基因治療》，6，1587-1593(1995)；《人體基因治療》，7，2177-2184(1996)；《病毒學(xué)雜志》，73，1601-1608(1999)]。這些作者明確指出，病毒保存系統(tǒng)地在-70℃/-80℃下完成。

自此曾表明，病毒結(jié)構(gòu)的演變(聚積和溶解)是一個(gè)非常依賴于如某些添加到溶液中反陽(yáng)離子濃度因素，也非常依賴于如腺病毒濃度因素的現(xiàn)象。在約1E12pv/毫升濃度以上，根據(jù)使用的藥物組合物，在幾小時(shí)至幾天內(nèi)可觀察到衣殼聚積和分裂作用(因此喪失感染能力)，而在低濃度下，這些現(xiàn)象變得比較緩慢。因此，長(zhǎng)時(shí)間保存高度濃縮的病毒顆粒組合物是特別困難的。

于是，人們發(fā)現(xiàn)并且構(gòu)成本發(fā)明目的的是，在溫度+4至+20℃之間，能夠在緩沖溶液中呈懸浮液狀保存在含水介質(zhì)中的感染重組病毒，所述緩沖液能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在弱堿性值，而緩沖液中被加入了甘油，但是未添加二價(jià)金屬陽(yáng)離子或堿金屬陽(yáng)離子。

更確切地，介質(zhì)的pH固定在8.0-9.6。

在添加甘油的緩沖液中含有腺病毒顆粒的液體或凍凝組合物屬于本發(fā)明的范圍。這些組合物具有的突出優(yōu)點(diǎn)是良好的穩(wěn)定性，同時(shí)特別適合長(zhǎng)期保存高濃度病毒顆粒。

根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⒔橘|(zhì)的pH固定在8.0-9.6的緩沖溶液，或者由含有Tris[三(羥甲基)氨基甲烷]或賴氨酸與選自強(qiáng)酸(例如鹽酸)或弱酸(例如馬來(lái)酸、蘋果酸或乙酸)的酸的酸/堿體系組成，或者由含有Hepes[2-(4-(2-羥基乙基哌嗪)-1-基)乙烷磺酸]和強(qiáng)堿(例如氫氧化鈉)的酸/堿體系組成。

優(yōu)選地，pH固定在8.4-8.8，更優(yōu)選地固定在8.4(在25℃測(cè)量值)。

以在對(duì)pH值不會(huì)產(chǎn)生不利影響的范圍或體積內(nèi)施加緩沖作用的方式確定緩沖液的濃度。酸+堿的摩爾濃度可以是10-500毫摩爾，優(yōu)選地是20-100毫摩爾，更優(yōu)選地是固定在20毫摩爾。在本發(fā)明的緩沖體系中，Tris/HCl緩沖溶液在濃度20毫摩爾可得到特別令人滿意的結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明，該組合物含有10-50％甘油，優(yōu)選地是20-25％(體積/體積)。