[發(fā)明專利]葡萄糖脫氫酶融合蛋白及其在表達系統(tǒng)中的用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00803879.1
• 申請日: 2000-02-08
• 公開（公告）號: CN1340104A
• 公開（公告）日: 2002-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: W·林克斯維勒;C·布格爾;O·普施克;U·哈夫曼;A·沃爾弗
• 申請（專利權(quán)）人: 默克專利股份有限公司
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/62;C12N9/04;C07K14/00;G01N27/26;C12Q1/32
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所
• 代理人: 周中琦

本發(fā)明涉及包括一種具有葡萄糖脫氫酶(GlcDH)的生物活性的蛋白序列作為一種成分的新重組蛋白，并且涉及其用于簡單的和有效的檢測任何優(yōu)選地作為融合伙伴的蛋白/多肽的應(yīng)用，以及快速優(yōu)化能夠表達所說的蛋白/多肽的表達系統(tǒng)的用途。

在這方面，GlcDH或具有GlcDH的生物活性的序列承擔標記物或檢測器蛋白的作用。此酶的一個特別的特征是對諸如SDS的變性劑的異常的穩(wěn)定性。GlcDH作為標記物或檢測蛋白，甚至在還原和變性條件的SDS-PAGE之后表現(xiàn)不減少的酶活性。因此，使用一種基于這一令人驚訝之行為的敏感性酶反應(yīng)，可以檢測包括GlcDH的融合蛋白。因此，以GlcDH作為標記物，快速地、低成本地和有效地檢測所要求的表達蛋白是可能的。

在許多情況下，GlcDH-蛋白/多肽融合蛋白以比沒有GlcDH更高的產(chǎn)量和穩(wěn)定性表達，也是可能的，特別是在E.coli中。因此，相應(yīng)的蛋白本身可被用于獲取和制備蛋白/多肽。

重組蛋白的體內(nèi)表達在生物技術(shù)中發(fā)揮的作用正在不斷增加。從諸如細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞的原核和真核表達系統(tǒng)獲取、純化和檢測所克隆的基因的產(chǎn)物的能力，也經(jīng)常被用于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究，蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用的研究，以及抗體生產(chǎn)和突變。借助于DNA重組技術(shù)特異性地修飾天然蛋白從而改善或改變其功能是可能的。重組蛋白在被連續(xù)地深入發(fā)展的，并且在此系統(tǒng)中許多不同地方可以被優(yōu)化的表達系統(tǒng)中合成。

重組蛋白合成的總過程可被分成兩部分。在第一步中有該基因的分子生物學(xué)分離和該靶蛋白的表達，在第二步中有從重組細胞或其生長培養(yǎng)基檢測和純化。在分子水平上，將蛋白的基因克隆到為此目的所提供的表達載體中，然后插入宿主細胞(原核或真核細胞)并在其中表達。細菌細胞在此線路中被證明是提供高產(chǎn)量的簡單的和有成本效益的表達系統(tǒng)。最常使用的宿主細胞是革蘭氏陰性細菌E.coli。

外源基因在E.coli中表達的目標是獲得最大可能量的生物活性重組蛋白，這被稱為超量表達。已知真核外源蛋白在此期間可能通過聚集，作為包函體，通過不正確的折疊或蛋白水解性降解，失去其生物活性。避免這些經(jīng)常出現(xiàn)的困難的一種可能，是所表達的蛋白作為分泌蛋白從細胞排出，或者使用所謂的融合蛋白，通過它不溶性重組蛋白可以可溶性形式存在于細胞中。

為了研究蛋白的功能和其對此功能重要的相互作用伙伴的功能，通常在真核細胞中表達蛋白。對此功能重要的翻譯后修飾，和正確的區(qū)室作用可以在其中進行。此外，存在對正確折疊和加工重要的其它蛋白。

真核表達系統(tǒng)也適合于表達相對大的蛋白和正確折疊要求諸如S-S橋形成、糖基化和磷酸化等轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白。因為這些系統(tǒng)通常是復(fù)雜而昂貴的，并且表達速率低于E.coli的表達速率，所以擁有一個快速、可靠、敏感和價格合理的檢測系統(tǒng)特別重要。

存在眾多檢測已經(jīng)通過重組形成的，并且其生物功能未知的外源蛋白的基因融合系統(tǒng)。在這些中，所表達的融合蛋白經(jīng)由功能已知的融合蛋白部分來檢測。

為了確定正確的表達、所表達的量、分子量和所形成的融合蛋白的功能活性，一種敏感的檢測系統(tǒng)是必要的。功能未知的蛋白的數(shù)量正在快速地增加，為其開發(fā)快速和有成本效益的檢測系統(tǒng)正變得越來越重要。對于多數(shù)基因融合系統(tǒng)，使用了諸如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或Western印跡的免疫學(xué)方法，其中通過重組形成的融合蛋白借助于特異性抗體檢測。

然而，相應(yīng)的融合蛋白不僅有所述的優(yōu)點，即外源蛋白可容易地間接檢測和分析；相反地，在許多情況下，他們允許所要求的蛋白以比沒有其融合伙伴之情形更高的產(chǎn)量表達。每一種融合伙伴都有優(yōu)點，在一個特別的表達系統(tǒng)中，不是不常見能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)移給另一種融合伙伴。因此，例如，一些蛋白對蛋白水解性[sic]降解的敏感性，當它是融合蛋白之形式[sic]時，可被降低。與單個成分比較，融合蛋白還常常具有比單個成分更良好的溶解性和分泌特性。

因此，有許多在異源宿主中進行基因融合表達重組蛋白的原因。這些原因有：提高外源蛋白的溶解性，提高可溶性外源蛋白的穩(wěn)定性，將外源蛋白定位在細胞的特定部分，利用已簡化的純化策略快速分離外源蛋白，融合蛋白被特異性切除的可能性，快速檢測來自未純化的細胞提取物的外源蛋白。

當前，有許多借助于基因融合系統(tǒng)測試重組蛋白表達的功能測試。這些包括通常使得從未純化的細胞提取物的直接檢測成為可能的簡單測試。然而，測試系統(tǒng)在花費的時間、處理量和敏感性上有相當?shù)牟町悺?/p>