[發明專利]電泳用的聚丙烯酰胺預制凝膠,其制法以及使用該凝膠的電泳法

無效

• 申請號: 00802294.1
• 申請日: 2000-11-30
• 公開（公告）號: CN1327537A
• 公開（公告）日: 2001-12-19
• 發明（設計）人: 鈴木美香
• 申請（專利權）人: 海茂株式會社
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 隆天國際專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳紅,潘培坤

本發明涉及電泳用的聚丙烯酰胺預制凝膠，其制法以及使用該凝膠的電泳法。

電泳用的聚丙烯酰胺預制凝膠，是蛋白質、糖質、脂質等構成生物體的重要物質的檢測和定量分析試劑，在生物學、醫學、水產學、獸醫學等多個領域中作為基礎研究手段而廣泛使用。特別是，聚丙烯酰胺凝膠，由于是人工合成的物質，通過改變配方，容易制成分離特性不同的凝膠。因此，使用大量生產的預制凝膠，使預先具有各種分離特性，可以大大省略分析的時間，均勻而再現性良好，所以，在該領域，對生產及質量管理的貢獻程度大。大量生產的預制凝膠，在供給它時，可以期待保存穩定性良好。

早先，電泳用的聚丙烯酰胺凝膠，按照噢隆斯達尹〔L.Ornstein，Ann.N.Y.Acad.Sci.121，321～349(1964)〕和戴維斯〔B.J.Davis，Ann.N.Y.Acad.Sci，121，404～427(1964)〕提出的方法，以及，按照萊姆理〔U.K.Laemmli，Nature，227，680(1970)〕提出的方法，廣泛用于蛋白質的生物化學醫藥分析，使用者制造凝膠加以使用。特別是萊姆理的方法，通過往凝膠和電泳用緩沖液中添加十二烷基硫酸鈉(下面稱作SDS)，可簡便地推定蛋白質的分子量，得到廣泛普及。萊姆理的方法，作為凝膠緩沖液，使用三(羥甲基)氨基甲烷(下面稱作Tris)的鹽酸部分中和物，作為電泳緩沖液，使用Tris及甘氨酸鹽(萊姆理的電泳緩沖液)。在該法中，凝膠緩沖液，用鹽酸部分中和Tris的約10～20％(摩爾)溶液，使pH達到8.8(萊姆理的凝酸緩沖液)。然而，在萊姆理的凝膠緩沖液的pH，酰胺基經受隨時間而變的水解反應。凝膠的水解反應，因為即使在低溫條件下也能進行，所以，聚丙烯酰胺凝膠部分具有陰離子基團。結果是，蛋白質的電泳距離變短，同時，分離像變得不鮮明，凝膠不可能長期保存。

其次，粗略看一下核酸的電泳。隨著分子生物學的進展，必須進行DNA、RNA的分析制備，然而，在這種核酸分析中，經常采用瓊脂糖電泳法以及聚丙烯酰胺凝膠電泳法。核酸在中性緩沖液中顯示帶強陰電，其移動度，由于作為支持體的凝膠分子篩的效果，根據作為對象的核酸的大小，經常采用0.3～2％左右的瓊脂糖凝膠或3.5％～20％左右的聚丙烯酰胺凝膠。

瓊脂糖凝膠，因為具有較大的孔徑，可在高分子的核酸作為分離分析對象的場合使用。瓊脂糖凝膠，因其電滲透的強弱、凝膠強度、熔點等的不同而有許多種類。另外，瓊脂糖是天然產物，即使同一公司同一種產品，根據載荷，可以見到各種各樣性狀的差異。另外，在瓊脂糖電泳法用于制備，精制DNA的場合，各種雜質混入瓊脂糖中，限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等酶活性受到阻礙，所以，要附加苯酚萃取等精制法。

一方面，聚丙烯酰胺凝膠具有較小的孔徑，可用于中分子～低分子核酸作為分離分析對象的場合。聚丙烯酰胺凝膠是合成的物質，具有化學高純度，所以，未發現瓊脂糖凝膠存在問題。另外，聚丙烯酰胺凝膠，通過改變配方，可容易地制出分離特性不同的凝膠。因此，采用大量生產的預制凝膠，使其預先具有各種分離能力，可大大省略分析時間，均勻而再現性良好，所以，在該領域對生產及質量管理的貢獻程度大。大量生產的聚丙烯酰胺凝膠，在供給它時，可以期待保存穩定性良好。在用于DNA電泳的場合，瓊脂糖凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠的緩沖液，主要是含有pH7.8～8.3的乙二胺四醋酸(下面稱作EDTA)或乙二胺四醋酸二鈉(下面稱作ETA)的三-醋酸緩沖液(下面稱作TAE)、三-硼酸緩沖液(下面稱作TBE)、三-磷酸緩沖液(下面稱作TPE)，凝膠緩沖液是與電泳用緩沖液的組成相同的連續緩沖液體系。

如上所述，大量生產的預制凝膠，在供給它時，可以期待保存穩定性良好。保存穩定性良好的凝膠的制造方法，是含有由Tris、兩性電解質及酸構成的凝膠緩沖液，長期保存穩定性優良的，并且，可能測定的分子量范圍顯著擴大的聚丙烯酰胺凝膠的制造方法，已在特開平4-184163號公報中公開。采用該制造方法制造的聚丙烯酰胺電泳凝膠，可用于萊姆理電泳用緩沖液的分析，它是其中含有兩性電解質pH4.0～7.5的凝膠緩沖液的凝膠，在其實施例中，舉出pH6.9～7.4凝膠的制造，經過冷藏保存4個月，蛋白質的移動度未發生變化，是穩定的。

凝膠緩沖液，目的是用于抑制聚丙烯酰胺凝膠的水解，將Tris的中和率設定在高值，另外，電泳凝膠中Tris的強酸部分和Tris的弱酸部分在邊界附近的電位坡度變化，由于兩性電解質的添加而變緩，和使用萊姆理的凝膠緩沖液制成的凝膠測定對象具有同等的分級分子量范圍。