[發明專利]櫻花素合酶基因

無效

• 申請號: 00800765.9
• 申請日: 2000-03-03
• 公開（公告）號: CN1302331A
• 公開（公告）日: 2001-07-04
• 發明（設計）人: 児玉治
• 申請（專利權）人: 科學技術振興事業團
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 張廣育,譚明勝

發明領域

本發明涉及水稻產生的櫻花素合酶(柚配基-7-O-甲基轉移酶，下文稱作“NOMT”)的基因組DNA，并涉及該基因組DNA的啟動子區。

發明背景

植物具有對病原體入侵的誘導型抗性，如產生植物抗毒素。

植物抗毒素是一種低分子量抗病原體物質，它的產生和積累不僅僅是因為病原體的入侵，而且還由于化學和物理脅迫。

例如，對水稻(Oryza?sativa)來說，櫻花素(5,4’-二羥基-7-甲氧基黃烷酮)是水稻的一種主要植物抗毒素，它是根據病原體感染和諸如紫外線輻射，氯化銅處理和茉莉酸處理而產生并積累的。

櫻花素是一種類黃酮，它一般被認為是一種植物抗毒素，起到保護植物免受諸如紫外線照射脅迫的作用。O-甲基轉移酶是一種參與所述類黃酮生物合成的酶，業已從各種植物組織和培養細胞中分離并純化了這種酶(Pakusch?AE等，Arch.Biochem.Biophys.271:488-494(1989)；Wanek?W等，植物197:427-434(1995))。

O-甲基轉移酶也與櫻花素的生物合成有關。櫻花素是通過NOMT對位于柚配基(一種黃烷酮，5,7,4’-三羥基黃烷酮)的7號位置上的羥基進行甲基化而合成的。

由于柚配基存在于多種植物中，可以通過導入能夠在植物中表達NOMT的DNA，在該植物中誘導櫻花素的產生，因此，該植物可以獲得明顯的抗細菌特性。

不過，尚未分離和鑒定到導入植物中之后能夠表達NOMT的DNA。

因此，有必要分離并鑒定在導入植物中之后能夠表達NOMT的DNA。

發明概述

本發明的目的在于提供在導入植物中之后能夠表達NOMT的DNA。

為了解決上述問題，我們業已進行了深入研究，并成功地鑒定了從水稻中分離并純化的NOMT的N-末端區的氨基酸序列(序列4)和C-末端區序列(序列5)，所述水稻受到過脅迫，例如，紫外線輻射，茉莉酸處理或氯化銅處理。用水稻的總的基因組DNA作模板，并用根據上述NOMT的部分氨基酸序列設計的DNA引物F1、F2、Rl和R2進行PCR。用由引物F2和R2通過PCR成功擴增的片段作為探針，篩選水稻基因組的BAC(細菌人工染色體)文庫。結果成功地分離并鑒定了水稻NOMT的基因組DNA(序列6)，因此完成了本發明。

具體地講，本發明提供了下面的(ⅰ)至(ⅹⅱ)。

(ⅰ)(a)含有序列6的核苷酸序列的DNA；或(b)在序列6的核苷酸序列上缺失、取代或添加一個或幾個核苷酸的DNA，該DNA在導入水稻或其他植物細胞中之后能夠表達具有NOMT活性的蛋白。

(ⅱ)含有(ⅰ)的DNA的重組載體。

(ⅲ)用(ⅱ)的重組載體轉化過的宿主細胞。

(ⅳ)通過分化導入了(ⅱ)的重組載體的植物細胞所獲得的植物轉化體。

(ⅴ)(a)含有序列12的核苷酸序列的DNA；或(b)在序列12的核苷酸序列上缺失、取代或添加一個或幾個核苷酸的DNA，該DNA在導入水稻或其他植物細胞中之后能夠表達具有NOMT活性的蛋白。

(ⅵ)含有(ⅴ)的DNA的重組載體。

(ⅶ)用(ⅵ)的重組載體轉化過的宿主細胞。

(ⅶ)通過分化導入了(ⅵ)的重組載體的植物細胞所獲得的植物轉化體。

(ⅸ)(a)含有序列2的核苷酸序列的DNA；或(b)在序列2的核苷酸序列上缺失、取代或添加一個或幾個核苷酸的DNA，該DNA具有啟動子活性。

(ⅹ)含有(ⅸ)的DNA的重組載體。

(ⅹⅰ)用(ⅹ)的重組載體轉化過的宿主細胞。

(ⅹⅱ)(a)一種含有序列3的氨基酸序列的蛋白；或(b)在序列3的核苷酸序列上缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸的蛋白，并具有NOMT活性。

本說明書包括在日本專利申請號11-57748中所披露的全部或部分內容，該專利是本申請的優先權文件。

附圖簡述

圖1表示在實施例3中獲得的水稻NOMT的基因組DNA(序列1)的內含子和外顯子的位置；

圖2表示引物F2和R2在實施例3中獲得的水稻NOMT的基因組DNA(序列1)上的預期的結合位置；

圖3表示在實施例4中獲得的水稻NOMT的基因組DNA(序列6)的外顯子的位置；

圖4表示在實施例4中獲得的水稻NOMT的基因組DNA(序列6)上的蛋白編碼區；