[發明專利]一種生產克隆牛的方法

無效

• 申請號: 00800602.4
• 申請日: 2000-06-30
• 公開（公告）號: CN1304443A
• 公開（公告）日: 2001-07-18
• 發明（設計）人: 李炳千;申泰英;盧湘鎬;林正默;樸鐘任;趙鐘基;金琪淵;李殷松;申秀晶;金晟基;宋吉永;黃禹錫
• 申請（專利權）人: 黃禹錫
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 王維玉,丁業平

本發明的背景技術

發明領域

本發明涉及一種生產克隆牛的方法，更具體地說，涉及一種生產由體細胞衍生的克隆牛的方法，此方法利用體外成熟、然后使卵母細胞去核、核轉移、電融合和激活胚胎、后激活并在體外培養胚胎，然后把胚胎移入代孕母牛中。本發明還涉及由上述方法生產的胚胎和克隆牛。

發明背景

人們長期考慮用受精生產動物，這涉及到雌雄配子。然而人們已經進行了巨大的努力生產具有相同的外貌和相同的遺傳特征的克隆動物。

30年來，已知只可能在兩棲動物中克隆受精卵，但目前已成功地在小鼠中通過置換單細胞受精卵的前核生產出克隆的子代(見：McGrath和Solter，科學，220:1300-1302,1983)。雖然在克隆動物上有了這個首例成功，畜牧業上的同樣成功(見：Wakayama等，自然，394:369-374,1998)卻報告得相當晚，因為用2-細胞期后的成熟卵母細胞和受精卵裂球生產克隆小鼠有幾個問題，例如重編程序的減少等。

有關通過核轉移生產克隆牲畜，首例報告是通過用8-到16-細胞受精卵的裂球作供體細胞生產綿羊的子代(見：Wiladsen，自然，320:63-65,1986)。此后，據認為通過核轉移只能克隆具有全能性的受精卵，籍此細胞可分化成每一個單細胞。然而，經過持續的研究工作，首例克隆綿羊是通過導入體細胞核生產的(見：wilmut等，自然，385:810-813,1997)，從而糾正了在先的發育理論，并使得在生產克隆牛(見：Welk，等，Reprod.Fertil.And?Develop.,10:369-378,1998)和豬方面出現了成功例的報告。

但是現有技術的方法被證實通過核轉移生產胚胎的產出量低下，在這個意義上是不太令人滿意的，其結果是克隆動物的生產率低下。

在此情況下，有強烈的理由探索和開發一種改進的方法，按照通過核轉移生產胚胎的思想生產體細胞衍生的胚胎。

發明概述

根據本發明，我們發現：通過縮短卵母細胞操作時間，和在供體細胞移入去核卵母細胞時加快核轉移及激活的速率可以急劇地增加通過核轉移生產的胚胎的產量，以此可以用有效的方式生產體細胞衍生的克隆牛。

因此本發明的首要目的是提供一種通過體細胞的核轉移生產克隆牛的方法。

本發明的另一個目的是提供通過所述方法生產的克隆牛胚胎。

本發明的又一個目的是提供通過所述方法生產的體細胞衍生的克隆牛。

附圖的簡要說明

由以下描述結合附圖會清楚了解本發明的上述目的和其它目的及本發明的特征，圖中：

圖1為供體體細胞的照片。

圖2是一張照片，表示用一根持定(細玻璃)管和一根切割(細玻璃)管切割受體卵母細胞由透明帶的過程。

圖3是一張照片，表示通過從受體卵母細胞取走第一極體和胞核進行去核的過程。

圖4是一張照片，表示用一根持定管和一根注射管把體細胞移入去核的卵母細胞的過程。

本發明的詳細描述

本發明生產克隆牛的方法包含以下步驟：制備從牛身上采集的供體體細胞系；在體外將從卵巢采集到的卵母細胞培育成熟；去掉卵母細胞周圍的丘(cumulus)細胞，切割成熟的卵母細胞透明帶的一部分并且擠出部分包括第一極體的胞質，以得到去核受體卵母細胞；通過把供體細胞注射進去核卵母細胞把核移入受體的卵母細胞，然后通過隨后的電融合和激活電融合后的細胞得到胚胎；后激活并且在體外培養胚胎；然后把培養的胚胎移入代孕母牛以生產克隆牛犢。

本發明的生產克隆牛的方法進一步說明如下。步驟1：制備供體細胞

把從牛身上采集的體細胞系制備成供體細胞。盡管沒有限制供體細胞的牛的品種，但優選用韓國牡牛(Bos?taurus?coreane)和荷蘭牛(Bostaurus)制備供體細胞。從牛身上采集的細胞系包括從子宮沖洗液、子宮內膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細胞或者胎兒成纖維細胞采集的細胞，可使用常規的公知方法稍加改動后，制備這些細胞系(Mather&Barnes，細胞生物學方法，第57卷，動物細胞培養方法，Academic?Press,1998)。