[發(fā)明專利]酶－蛋白質(zhì)復(fù)合物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00136479.0
• 申請日: 2000-12-21
• 公開（公告）號: CN1300942A
• 公開（公告）日: 2001-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 大林弘一;北野由里子
• 申請（專利權(quán)）人: 株式會社日冷
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 盧新華,楊麗琴

本發(fā)明涉及一種酶、蛋白質(zhì)和載體復(fù)合物，此復(fù)合物是通過將具有特異結(jié)合其他物質(zhì)能力的蛋白質(zhì)結(jié)合到與載體共價(jià)結(jié)合的酶上而制備。這種復(fù)合物可用于免疫測定，如用于免疫組織化學(xué)和酶免疫測定等。

由于最近時(shí)期免疫化學(xué)上的進(jìn)展，利用抗原-抗體反應(yīng)來高靈敏地檢測痕量物質(zhì)的免疫測定術(shù)被廣泛應(yīng)用。目前，通常采用的兩種免疫測定是免疫組織染色和酶免疫測定。

免疫組織染色是一種用識別特異性抗原的抗體來檢測組織中特異性抗原的的方法。一般地，抗原抗體識別反應(yīng)是在一薄的組織切片上進(jìn)行的，組織切片的制備包括固定和石蠟包埋等步驟。抗原的存在與否是通過與之反應(yīng)的抗體的有無來確定。首先被用來與抗原反應(yīng)的抗體通常稱為一抗。當(dāng)與一抗結(jié)合的物質(zhì)發(fā)出可見或可被儀器檢測的信號時(shí)，信號的強(qiáng)度即顯示一抗的量，而一抗的量是與樣品中抗原的量呈正相關(guān)的。能夠發(fā)出信號的物質(zhì)有熒光物質(zhì)和酶等。在免疫組織染色的早期發(fā)展階段主要是利用熒光物質(zhì)，而那樣就必須用熒光顯微鏡來檢測信號。

隨后，Nakane等發(fā)展了酶標(biāo)抗體的方法，使得用普通光學(xué)顯微鏡來分析染色圖象成為可能。目前，酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用為發(fā)出信號的物質(zhì)。在免疫組織染色中，通過對結(jié)合在一抗上的酶引入發(fā)色物質(zhì)來產(chǎn)生顯色反應(yīng)，而顯色反應(yīng)的強(qiáng)度顯示了相應(yīng)的酶活性。因此，顯色反應(yīng)的強(qiáng)度也就顯示了酶標(biāo)抗體的量，也即組織樣品中抗原的量。然而，用這種方法可能得不到足夠的靈敏度。

目前通常采用的方法稱為鏈霉抗生物素蛋白-生物素法(SAB法)，即一種放大結(jié)合在抗原上的一抗的信號的方法。此方法包括首先使識別組織樣品中特異性物質(zhì)的一抗與之反應(yīng)，然后加入能結(jié)合一抗的第二抗體。通常，二抗是能識別并結(jié)合一抗的多克隆抗體。這樣，多個分子的二抗就被結(jié)合到一抗上。而每個二抗分子上已經(jīng)被事先結(jié)合上了多分子的生物素。而隨后用結(jié)合上鏈霉抗生物素蛋白的酶來與此一抗-生物素結(jié)合的二抗復(fù)合物反應(yīng)。由此形成了一抗-生物素結(jié)合的二抗-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的酶的復(fù)合物。因?yàn)槊總€一抗分子上結(jié)合了多分子的生物素結(jié)合的二抗分子，而每個生物素結(jié)合的二抗分子上又結(jié)合了多分子的鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的酶，間接結(jié)合在一抗分子上的酶量得以顯著增加。這就使得組織樣品上的抗原被以極高的靈敏度檢出。

如前所述，由于結(jié)合在抗原上的一分子一抗上可最終結(jié)合多分子的酶，而這樣就產(chǎn)生了更強(qiáng)的信號，因此，SAB法是一種很好的免疫測定方法。然而，從另一方面講，此方法要求三個步驟：一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)和酶制劑反應(yīng)。由于要求煩瑣的步驟，SAB法不能在要求簡捷、快速和精確的臨床應(yīng)用等方面廣泛使用。因此，SAB法有待改進(jìn)。

另外一種常用的免疫測定術(shù)被稱為酶免疫測定(EIA)，經(jīng)典的酶免疫測定方法和步驟如下：首先，用來識別某種待測物質(zhì)的抗體被固定在聚苯乙烯珠或微量培養(yǎng)板等載體上。在載體被清蛋白等封閉后，作為待測目標(biāo)的含有抗原的樣品溶液被滴加。隨后，再加入結(jié)合上酶的識別特異性抗原的抗體(酶標(biāo)抗體)。換句話說，抗原被“插”到兩個抗體的之間。接著洗去多余的酶標(biāo)抗體，用酶的顯色底物來發(fā)生顯色反應(yīng)。因?yàn)榭乖牧坑擅傅幕钚远ǎ瑯悠分锌乖臐舛染涂梢酝ㄟ^和已知濃度抗原的顯色反應(yīng)來比較而確定。許多因素影響酶免疫測定的靈敏度，其中酶標(biāo)抗體的質(zhì)量是最重要的因素之一。尤其重要的是，當(dāng)酶標(biāo)抗體上結(jié)合了更多酶分子時(shí)，更強(qiáng)的信號被檢測到，而這樣抗原就可以被高靈敏度的測定。

如前所述，對免疫測定而言，酶標(biāo)抗體的質(zhì)量就顯得尤為重要，酶標(biāo)抗體的質(zhì)量極大的影響著測定體系的靈敏度和測定步驟的煩瑣程度。下面數(shù)例闡明了為使酶標(biāo)抗體達(dá)到更高的靈敏度而采取的不同的嘗試。這些嘗試大部分包括在某種載體上結(jié)合更多的酶和抗體。

在日本專利申請公開(Japanese?Patent?ApplicationPublication)JP-A63-503138(1988)中，抗體被結(jié)合到已經(jīng)結(jié)合上可檢測標(biāo)記衍生物的載體上，可檢測標(biāo)記包括藥物、毒素、螯合劑和硼加合物等。利用氨基葡聚糖作為載體，首先，一種藥物例如氨甲蝶呤(methotoxate)被結(jié)合到氨基葡聚糖上；在過碘酸鈉存在的條件下抗體的糖鏈被氧化產(chǎn)生醛基，醛基和氨基葡聚糖反應(yīng)，隨后，由氫硼化氰還原產(chǎn)生共價(jià)鍵，從而形成藥物、抗體和氨基葡聚糖復(fù)合物。

在日本專利申請公開(Japanese?Patent?ApplicationPublication)JP-A3-158758(1991)中，由過碘酸鈉氧化葡聚糖產(chǎn)生的醛基與堿性磷酸酶和抗體的氨基反應(yīng)，再用氫硼化鈉還原，從而制備酶、抗體和葡聚糖復(fù)合物。