[發明專利]甘露糖的定量測定方法及其試劑

無效

• 申請號: 00133945.1
• 申請日: 2000-11-09
• 公開（公告）號: CN1296172A
• 公開（公告）日: 2001-05-23
• 發明（設計）人: 海老沼宏幸;牛澤幸司
• 申請（專利權）人: 第一化學藥品株式會社
• 主分類號: G01N21/25
• 分類號: G01N21/25;G01N33/50;C12Q1/32
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 章鳴玉

本發明涉及用酶學方法精確和方便地定量測定甘露糖的方法及定量測定用試劑。

甘露糖是己糖型的，微量存在于人血。作為供應途徑，已知主要通過葡萄糖代謝系統供應甘露糖，而不是通過食物的攝入。甘露糖的血濃度通常低至約0.5mg/dl。但是，已知在患者罹患糖尿病時該濃度有高的傾向，這些患者缺乏控制血糖(Clinca.Chimica?Acta?251；1996?pp?91-103)或真菌感染(J.Clin.Microbiol.21(6)；1985?pp?972-979)的能力，有人提議甘露糖濃度對于這些疾病的診斷有用。

測定甘露糖的方法已知有氣相色譜法(Clin.Chem.25；1979；pp?1384-1387)、液相色譜法(Bulletin?of?Japan?Urology?Association，80；1989；pp1816-1823)酶學方法(Clin.Chem.30(2)；1984?pp?293-294)等。

例如，在酶學方法中，因為如果樣本或樣品中含有葡萄糖則難以進行精確測定，所以必須消除葡萄糖。在Soyama等的方法(Clin.Chem.30；1984?pp?293-294)中，先用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶消除樣本中的葡萄糖。然后，在三磷酸腺苷(下文稱作ATP)存在下，將甘露糖與己糖激酶反應，將其轉化為甘露糖-6-磷酸，再與甘露糖-6-磷酸異構酶反應轉化為6-磷酸果糖，進一步與葡糖-6-磷酸異構酶反應，將其轉化為葡糖-6-磷酸，最后，在輔酶氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文稱作NAD)存在下，與葡糖-6-磷酸脫氫酶反應，然后，用分光光度計測定所形成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文稱作NADH)的吸光度(340nm)以定量測定甘露糖。

作為上述酶學方法的改進，Pitkanen等報告了一種定量測定甘露糖的方法(Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem?35(10)；1997?pp761-766)，其中，在ATP和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文稱作NADP)存在下，將己糖激酶和葡糖-6-磷酸異構酶與同時存在葡萄糖和果糖的樣本反應，從而將葡萄糖和果糖轉化為葡糖-6-磷酸；再加入葡糖-6-磷酸脫氫酶將葡糖-6-磷酸轉化為葡糖酸內酯-6-磷酸；所形成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文稱作NADPH)用鹽酸在酸性條件下降解以消除葡萄糖等的影響；然后以上述同樣的方法，在ATP和NADP存在下，將甘露糖與己糖激酶、甘露糖-6-磷酸異構酶、葡糖6-磷酸異構酶和葡糖-6-磷酸脫氫酶反應，測定所形成的NADPH的吸光度(340nm)。

但是，在上述酶學方法中，由于需要處理復雜的酶接合系統，其中各種酶促反應結合在一起，因此難以使所有酶處于最適條件。而且，由于各種昂貴的酶結合在一起使用，因此在成本方面有問題。此外，還有一個缺點，即這些方法對來自生物樣本或雜質的成分的影響敏感。

另一方面，在氣相色譜法和液相色譜法中，必須進行麻煩的操作，如衍生化或諸如熒光之類標記，及使用特殊儀器，因此這些方法不適合于處理大量樣本。

本發明的一個目的是提供定量測定甘露糖的方法及定量測定用試劑。用它們可進行大量樣本的精確和方便的處理。

為了完成上述目的，一方面，本發明提供定量測定甘露糖的方法，包括在電子接受體存在下將樣本中的甘露糖與能通過脫氫反應氧化甘露糖的酶進行反應，并定量測定所形成的電子接受體還原物。

上述方法中，當樣本除甘露糖外還含有葡萄糖時，較佳為在與酶反應前用葡萄糖消除劑將樣本中的葡萄糖轉化為不與酶反應的結構。

上述方法中，酶較佳為屬于酶編號EC類1.1.1.119的葡萄糖脫氫酶，更佳為來自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。作為樣本，較佳為選自血液、血清、血漿、腦脊液和尿液的至少一種生物樣本，或從所述生物樣本制得的樣本。

另一方面，本發明提供定量測定用試劑，包括在電子接受體存在下能通過脫氫反應氧化甘露糖的酶，及對酶有用的電子接受體。

該試劑較佳還包含葡萄糖消除劑。此外，酶較佳為屬于酶編號EC類1.1.1.119的葡萄糖脫氫酶，更佳為來自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。此外，葡萄糖消除劑較佳為包含葡萄糖6-位磷酸化酶和腺苷三磷酸。且電子接受體為輔酶NADP。

按照本發明，由于酶直接與甘露糖反應，并能通過脫氫反應氧化甘露糖，無需通過復雜的酶接合系統進行測定，因此能方便地定量測定葡萄糖及進行大量樣本的處理。而且，使用葡萄糖消除劑時，測定幾乎不受樣本中葡萄糖的影響，因此能精確地定量測定甘露糖。