[發(fā)明專利]編碼pfk基因的新核苷酸序列

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 00132502.7
• 申請(qǐng)日: 2000-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN1297055A
• 公開（公告）日: 2001-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 貝蒂娜·默克爾;瓦爾特·普費(fèi)弗勒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 德古薩－于爾斯股份公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/31;C12N15/52;C12P19/34;C12P13/04;C12P13/08
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發(fā)明提供了編碼pfk基因的核苷酸序列，和通過(guò)具有增強(qiáng)的pfk基因的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴氨酸的方法。

氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，特別是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。

已知氨基酸可通過(guò)棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過(guò)離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。

為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對(duì)抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的調(diào)節(jié)代謝物營(yíng)養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸如L-賴氨酸的菌株。

一段時(shí)間以來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法也用于棒桿菌生產(chǎn)氨基酸的菌株的改良，其是通過(guò)擴(kuò)增各個(gè)生物合成基因并研究對(duì)氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行。這一主題的綜述文章可在Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Soloman編輯，BenjaminCummings，英國(guó)倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec?2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6：261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技術(shù)學(xué)關(guān)鍵綜述15，73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)學(xué)會(huì)年報(bào)782，25-39(1996))。

本發(fā)明人目的在于為改良氨基酸尤其是L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)而提供新措施。

氨基酸、尤其是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，特別是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，因此提供生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。

當(dāng)下文提到L-賴氨酸或賴氨酸時(shí)，不僅是指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。

本發(fā)明提供了一種來(lái)自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列：

a)與編碼包括SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，????

b)編碼包括與SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及

d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。

本發(fā)明還提供了根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其優(yōu)選包括能復(fù)制的DNA，包括

(ⅰ)SEQ?ID?NO：1的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或

(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地，

(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。

本發(fā)明還提供了

權(quán)利要求4的多核苷酸，包括SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，

權(quán)利要求6的多核苷酸，其編碼包括SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的多肽，

包括權(quán)利要求1的多核苷酸序列的載體，特別是穿梭載體或質(zhì)粒載體，

以及作為宿主細(xì)胞的含有載體的棒狀細(xì)菌。

本發(fā)明還提供了基本上包括多核苷酸序列的多核苷酸，其可通過(guò)用包括相應(yīng)于SEQ?ID?NO：1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交合適的基因文庫(kù)，并分離所述的DNA序列來(lái)篩選獲得，所述的文庫(kù)包括具有相應(yīng)于SEQ?ID?NO：1的所述多核苷酸序列的完整基因。

本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼果糖磷酸激酶的全長(zhǎng)cDNA，以及分離與果糖磷酸激酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。

本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼磷酸果糖激酶的基因的DNA的引物。

作為探針或引物的這種寡核苷酸包括至少30個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)、特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。具有至少40或50個(gè)核苷酸的寡核苷酸也是合適的。

“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來(lái)。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。

“多肽”應(yīng)理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的多肽包括SEQ?ID?NO：2的多肽，特別是具有果糖磷酸激酶生物學(xué)活性的多肽，以及與SEQ?ID?NO：2的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ?ID?NO：2的多肽至少80％、特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。