[發明專利]人Neurturin結構類似物多肽、其編碼序列及其制備方法

無效

• 申請號: 00130255.8
• 申請日: 2000-11-01
• 公開（公告）號: CN1311331A
• 公開（公告）日: 2001-09-05
• 發明（設計）人: 馬雪梅;黃秉仁
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發明涉及一種人Neurturin結構類似物多肽，其與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個氨基酸。本發明還涉及編碼所述人Neurturin結構類似物多肽的多核苷酸，含有所述多核苷酸的表達載體，用該表達載體轉化的大腸桿菌，以及生產所述人Neurturin結構類似物多肽的方法。

本領域公知的是，在大腸桿菌中表達異源蛋白常遇到表達量低和形成不溶性包涵體的問題。采用表達融合蛋白的策略(如與TrxA,GST等融合)、降低溫度等方法雖可部分解決問題，但很多情況下，基因本身的編碼序列對表達的影響更顯著。在原核生物中，由于不同的tRNA在含量上的差異很大，產生了對密碼子的偏愛性，從而影響了基因的表達，特別是靠近起始密碼區稀有密碼子的聚集對表達的抑制更嚴重(Hu等，蛋白質表達與純化，7,289-293,1996)。另外研究表明在成熟蛋白N末端存在精氨酸時常會影響其表達和穿過內膜的功能(Andersson等，FEBS通信，347,169-172,1994)。

Neurturin(NTN)是1996年底新發現的神經營養因子，其成熟肽與GDNF有42％的同源性，它們共同組成了TGF-β超家族的一個亞家族。NTN對多巴胺能神經元、運動神經元及外周神經系統的各類交感神經元、感覺神經元等都有很強的營養作用和損傷修復作用，為帕金森病及肌萎縮側索硬化癥(ALS)等神經退行性疾病和神經損傷疾病的治療開辟了新的途徑。由于這些因子在體內含量甚微，提取困難，造價昂貴，利用E.coli來生產，具有低成本、高效率、短周期的特點，已越來越成為人們研究的熱門領域。但是已有的實踐表明，人Neurturin蛋白在原核系統的表達不是令人滿意，究其原因，可能是由于人Neurturin基因5′端有多個稀有密碼子聚集，且第二個氨基酸為精氨酸。因此，本發明人由此入手，通過缺失和突變編碼人Neurturin基因的5′端序列而在體外高效表達和制備具有Neurturin活性的人Neurturin結構類似物多肽，因而具有重要的理論意義和臨床應用價值。

因此，本發明的目的在于提供一種編碼人Neurturin結構類似物多肽的DNA序列，該DNA序列能在原核系統如大腸桿菌中高產量表達。

本發明的再一目的在于提供所述的人Neurturin結構類似物多肽

本發明的又一目的在于提供生產人Neurturin結構類似物多肽的方法。

根據本發明的一個方面，本發明提供了編碼人Neurturin結構類似物多肽的DNA序列，其特征在于，其表達產物與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個氨基酸，并且在不改變所編碼的氨基酸組成的前提下，該多核苷酸的5′端有4個密碼子突變為4個大腸桿菌嗜用的密碼子。在本發明的一個實施方案中，本發明的DNA序列如SEQ?ID?NO:1中的核苷酸序列所示。在SEQ?ID?NO:1中，編碼人Neurturin蛋白的N-末端頭兩個氨基酸Ala和Arg的兩個密碼子被缺失(在SEQ?ID?NO:1以橫線示出)，另外，編碼人Neurturin蛋白的N-末端第3、4、6和9位氨基酸的密碼子被突變為大腸桿菌嗜用的密碼子，突變涉及T→C,G→T,G→T,G→C的突變(在SEQID?NO:1中以斜體示出)。本發明的DNA序列可摻入任何已知的原核表達載體，從而在原核系統特別是大腸桿菌中高效表達。例如，在本發明的一個實施方案中，本發明的DNA序列摻入表達載體pHM39(本發明人構建，其圖譜見圖1)中，構建成重組表達載體pHM39-NTNLM，然后用該重組表達載體轉化大腸桿菌菌株HB101。由此得到的轉化菌株命名為HB101-NTNLM，其于1999年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?NO.0421。另外，為促進對表達產物的純化，本發明的多核苷酸可與例如六組氨酸標記序列融合，以利于用金屬螯合親和層析法對表達產物進行純化。本發明的DNA序列也可與硫氧還蛋白編碼基因或pelB基因融合以提高表達產量及產物的可溶性。

本發明的另一方面涉及利用大腸桿菌細胞制備人Neurturin結構類似物多肽的方法，所述的方法包括將本發明的DNA序列克隆到原核表達載體中，以重組表達載體轉化大腸桿菌，最后分離純化表達的人Neurturin結構類似物多肽。如此獲得的產物的表達量占菌體總蛋白的5-30％，其中可溶性表達占20-40％，天然NTN蛋白則沒有可溶性表達。并且所表達的人Neurturin結構類似物多肽經純化后具有完好的生物學活性(見實施例部分)。