[發明專利]從魚類的精原細胞中提取DNA的方法

無效

• 申請號: 00129987.5
• 申請日: 2000-10-23
• 公開（公告）號: CN1302810A
• 公開（公告）日: 2001-07-11
• 發明（設計）人: 樸韓浯;李仁雨
• 申請（專利權）人: 株式會社百尼爾
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 王維玉,丁業平

本發明涉及從魚類的精原細胞中大量提取脫氧核糖核酸(DNA)的方法。

脫氧核糖核酸(DNA)作為遺傳信息密碼的生物高分子，廣泛存在于所有生命體中。DNA是由磷酸、4種堿基、脫氧核糖形成的生物高分子，因具有固有的物理化學和生物學特性，廣泛用于生化實驗材料、化妝品、醫藥、食品添加劑等。

另外，烏賊的精原細胞是加工烏賊過程中大量得到的副產物。烏賊捕獲后，大部分加工成烏賊干或魷魚干等，在此過程中烏賊的內臟作為副產物產生。此外，烏賊的魚子和精原細胞作為飯館等的基本菜使用。烏賊的精原細胞中含有豐富的DNA，因此比其他原料更容易得到DNA。DNA以往從鯡魚或大馬哈魚的精原細胞中提取，從明太魚的精原細胞中用陰離子表面活性劑和氯化鈉提取DNA方法記載在韓國專利第35973號中。

以往大量提取DNA的方法可舉出使用苯酚的方法(美國專利第3838148號)、使用陰離子表面活性劑和高濃度氯化鈉的方法(韓國專利第35972號)等。這些方法在提取過程中大量產生公害物質，而且這些公害物質處理費用高。本發明為解決這些問題，提供完全不產生公害物質，并且其廢液可用作肥料的方法。

因此，本發明著眼于精原細胞大量含有DNA，發現用含有高濃度鹽的堿性溶液，可以非常經濟地精制DNA，由此完成本發明。本發明的目的是代替對人體有害的苯酚、陰離子表面活性劑SDS(十二烷基硫酸鈉)、有害于土壤的氯化鈉等環境污染物質，使用土壤復活改善劑物質，把從魚類精原細胞中提取DNA工藝所產生的副產物全部用作植物營養源，該方法比以往方法簡便且容易提取DNA。

另外，本發明的其他目的是將所述方法中的副產物作為液體氮肥。

為達到本發明所述目的，從魚類的精原細胞中提取DNA的方法包括：

A)破碎、分離魚類的精原細胞，得到乳白色的膠體；

B)用含有1M以上的pH值為8～12的一價離子鹽的堿性溶液處理所述膠體；

C)向上述混合物中加入乙醇，沉淀DNA。

另外，本發明的從魚類的加工副產物---精原細胞中提取DNA的方法，由A)將魚類的精原細胞加入到含有1M以上的pH值為8～12的一價離子鹽的堿性溶液中并進行破碎；B)在所述破碎溶液中加入酸酐進行酰化反應；C)在酰化反應的破碎溶液中加入乙醇沉淀DNA的步驟組成的。

本發明中可使用多種多樣的魚類精原細胞，但最好使用廉價并容易大量購得的烏賊、明太魚的精原細胞。

將魚類的精原細胞與蒸餾水一起在粉碎機中粉碎形成膠狀，再用篩過濾，除去未粉碎的部分后，可加入含有高濃度鹽的堿性溶液。另外，本發明的方法可在含有高濃度鹽的堿性溶液中破碎魚類的精原細胞，魚類的精原細胞同蒸餾水一同破碎，并且該溶液用高濃度鹽溶液處理后，再用pH值為8～12的堿性溶液處理。

本發明的方法也可增加酰化反應步驟，而所述酰化反應是在堿性溶液處理的破碎溶液中加入酸酐進行的。本發明的酸酐可使用乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐等。

本發明的方法中可使用的堿性化合物有硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸鈉等。

所述A)步驟后也可增加RNA分解步驟。RNA的分解采用堿處理或RNA酶(RNase)分解。

下面詳細說明本發明。

如果破碎細胞，核酸結合蛋白質在高濃度鹽中顯示更強的正電性，弱化了與DNA的吸附狀態，而與DNA分離。魚精蛋白類的核酸蛋白質的蓖麻子白朊含量非常高。蓖麻子白朊基由于含有氨基，在高濃度鹽中顯示正電性。核酸結合蛋白質內顯示正電性的氨基被堿性溶液脫正電性，而成為反應性極大的作用基與酸酐反應，因此失去與DNA的離子結合性親和力(Roger?L.Lundbland?and?Claudia?M.Noyes.,Chemical?Reagents?for?Protein?Modification,Vol.I?CRC?Press,Inc.,1984,page?130～131；Riordan,J.F.And?Vallee,B.L.,Acetylation,Meth.Enzymol.,11,page?565～570,1967)。另外，堿性溶液可以水解RNA。因此，不另外使用RNase也能分解RNA得到核酸。

所述脫正電性的氨基與酸酐反應，蛋白質的氨基和RNA的氨基被酰化，失去正電性，因此，即使堿性鹽的濃度低，核酸結合蛋白質也不可能再次與DNA連接。然后，加入乙醇，DNA以纖維狀態從溶液中分離，將其收集并用乙醇洗滌、干燥，得到白色DNA纖維。