[發明專利]水蛭素基因hv2－47k及其合成與表達

無效

• 申請號: 00129747.3
• 申請日: 2000-10-10
• 公開（公告）號: CN1348003A
• 公開（公告）日: 2002-05-08
• 發明（設計）人: 黃秀東;游自立;呂志強;肖建國;于廷和;王立兵
• 申請（專利權）人: 梅伯皋
• 主分類號: C12N15/15
• 分類號: C12N15/15;C12N15/63;C12N15/81;A61K38/58
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種重組藥物，特別是水蛭素基因及其合成與表達。

水蛭素(Hirudin)最早是從日本醫蛭(Hirudomedicinalis)唾液腺中分離得到的一類多肽。之后，研究者從各種嗜血水蛭中分離得到的水蛭素變異體不下于20種，它們大都是由60多個(64-69個不等)氨基酸殘基組成，其中研究應用最多的是由65或66個氨基酸組成的三種變異體(HirudinVariants)，分別稱為HV1、HV2和HV3，所有天然水蛭素C-端第63位酪氨酸Tyr(Y)均硫酸酯化(RobertHand，et?al?Transgenica-Topics?in?Clinical?Biotechnology?http：//pharminfo.com/pubs/transgen/th-hir.html)。

水蛭素對人及其他哺乳動物的凝血酶均有很高的親和力，是迄今發現的最強的凝血酶天然抑制劑。它是通過同凝血酶的催化中心及纖維蛋白原結合中心發生不可逆的結合，使凝血酶失活。一分子的水蛭素與一分子的凝血酶形成牢固的、非共價的復合物，因此，失活的凝血酶基本上是不可逆的，這就使纖維蛋白原的轉化及凝血酶介導的血小板的激活過程被阻斷。

水蛭素的N-端(1～39)主要含有疏水性氨基酸，通過三個鏈內二硫鍵來穩定，而C-端(40～65)富含酸性的氨基酸，其中C-端的10個氨基酸殘基組成的肽段，是特異性結合凝血酶并使之失活的關鍵區域。對HV1和HV3的47位賴氨酸(K)殘基研究發現，K對水蛭素的活性及其同凝血酶的相互作用也很重要(Mao，S.J.T.，etal.，Anal.Biochem.161：514-518，1987；Harvey，R.P.，etal.，PNAS(USA)83：1084-1088，1986；Dodt，J.，etal.，FEBSLett.2?29：87-90，1988)。HV2的47位賴氨酸可能通過氫鍵和靜電相互作用同時影響水蛭素的三維結構以及其同凝血酶的結合，使其熱穩定性增加，生物活性提高61％(鹿峪峰等中國生物化學與分子生物學學報，1998；14(1)：32-37)

鑒于天然水蛭素來源有限，80年代后期，國內外都開始研究采用基因工程技術生產重組水蛭素，以滿足藥理及臨床研究試驗的需要。目前國外從事水蛭素基因工程研究開發的公司不下于11家。其中德國Hoechst公司將HV2的N端第一位的異亮氨酸(I)變為亮氨酸(L)，生產的第二63位酪氨酸Tyr脫硫水蛭素Lepirudin(化學名：Leu1，Thr2-63-desulfohirudin，商品名REFLUDAN)，其粉針劑已于1998年先后在歐洲和美國上市，用于治療肝素誘發的血小板減少癥(HIT，Heparin-induced?thrombocytopenia)。瑞士的Ciba-Geigy(NOVARTIS)公司采用重組技術在啤酒酵母中表達的第63位脫硫水蛭素，命名為Desirudin，商品名Revasc，主要用于骨科手術及其他大手術后的并發癥，如深部靜脈血栓(DVT，Deep?vein?thrombo-sis)及肺栓塞(PE，Pulmonary?embo?lism)，現已經在歐洲上市(Aventis-Refludan?Prescribing?Information?http：//www.Aventispharma-s.com/Pis/refludan-TXT.html)。

經過綜合分析后，我以HV2的氨基酸序列為主體，同時參考HV1、HV3的序列，將HV2的47位的天冬酰胺(N)取代為賴氨酸(K)，選用甲醇酵母Pichia?pastoris所喜好的遺傳密碼子，人工合成8段寡核苷酸鏈(引物)(鏈長31-46堿基不等)，采用遞歸式PCR(Recursive?PCR)(畢群，黃儀秀，朱圣庚水蛭素基因的遞歸PCR合成和在大腸桿菌中的表達與分泌北京大學學報(自然科學版)33(6)：737-742，1997)，拼接新型水蛭素hv2-47K該基因將之插入到Pichia酵母分泌型表達載體pPIC9中，構建表達載體PIC8.2。用此載體轉化Pichia酵母，獲得高效表達的工程菌。本發明的主要內容是：1.hv2-47k基因的合成