[發明專利]海水魚二聯弧菌滅活疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 00129465.2
• 申請日: 2000-12-29
• 公開（公告）號: CN1360948A
• 公開（公告）日: 2002-07-31
• 發明（設計）人: 孫修勤;張進興;曲凌云
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第一海洋研究所
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61P43/00
• 代理公司: 青島海昊專利事務所
• 代理人: 張中南

本發明涉及人工養殖海水魚疾病的預防用疫苗，具體說涉及海水魚二聯弧菌滅活疫苗的制備方法。

已有技術系用藥物防治，由于長期使用藥物會使魚類產生耐藥性，因而防治效果不佳。海水魚養殖是我國海水養殖的第四次浪潮，為了防止疾病危害，必需及早研制養殖海水魚的防病疫苗和實現疫苗的現場投予。研究發現，付溶血弧菌和鰻弧菌是引起海水魚皮膚潰瘍、眼球混濁及其它多種疾病的病原。

本發明的目的是提供一種能預防上述海水魚疾病的二聯弧菌滅活疫苗的制備方法。

本發明的另一目的是提供一種將滅活疫苗合理應用、即現場投予的方法。????

本發明的制備方法是先從病魚體內分離出致病的付溶血弧菌和鰻弧菌兩種病原，之后將上述病原菌在生物反應器中依一定的條件大量培養，再用福爾馬林滅活，靜置一天后離心收集，分別收到相應的菌體，使用時以1∶1比例將上述兩種菌體混合，即為二聯弧菌滅活疫菌。也就是將引起上述疾病的兩種病原菌滅活，消除其對受免魚的毒性，同時利用上述兩種病原菌的抗原，使魚類產生相應的抗體，從而達到預防疾病發生的目的?，F場投予則靈活選擇投喂免疫或浸泡免疫。

本發明是生物技術與魚類免疫技術學的結合，方法簡單、安全，產生的疫苗為滅活疫苗，免疫效果明顯。而疫苗的現場投予合理方便，采用投喂和浸泡兩種皆可。

本發明的制備方法，包括兩種弧菌的分離、接種、斜面培養和利用生物反應器擴大培養及菌體滅活與收集，然后將兩種滅活菌體按1∶1比例混合制成二聯弧菌滅活疫苗使用。

本發明的具體方法如下：(1)首先選擇2216-E作為培養基。將從病魚體內分離的鰻弧菌和付溶血弧菌，分別接種到2216-E固體培養基斜面上，并在溫度28±0.2℃下培養3-4天，待菌落生長旺盛時，即可用于生物反應器的擴大培養。

(2)先將高壓滅菌后的2216-E液體培養基注入無菌的生物反應器中，鰻弧菌和付溶血弧菌分別培養，即將兩種菌分別從前述斜面培養基上取菌落接種入生物反應器內。反應溫度保持30±0.2℃，攪拌速度為600rpm，通氣量為4L/min，培養24小時左右，即當反應器內溶氧量趨于平衡時，菌體生長達到高峰，停止反應。

(3)取出菌液，加入0.5％(v/v)福爾馬林液，靜置24小時。

(4)靜置后，以4000rpm離心15分鐘，分別收集沉積的、滅活后的付溶血弧菌和鰻弧菌菌體。

(5)最后將兩種滅活菌按1∶1比例混合制成二聯弧菌滅活疫苗使用。

在制備中還應考慮安全性檢查以及滅活疫苗的保存。用滅菌生理鹽水，將滅活后的上述兩種菌體洗凈、去除福爾馬林。再用白金耳挑取少許菌體，在2216-E固體平板培養基上劃線，在溫度為28±0.2℃下培養3-4天，若無菌落出現，則證明滅活徹底。

該疫苗的保存方法系將二種滅活的菌體分別置于-20下冷凍保存。

作為其應用，可將制成的疫苗，即將滅活的鰻弧菌和付溶血弧菌二聯疫苗進行現場投放，其方法有兩種：

A、投喂免疫：將兩種滅活疫苗各1克，加入每千克魚體重所

???需的飼料中混勻，連續投喂10天。

B、浸泡免疫：將凍結的疫苗融化后，用海水稀釋1000倍，

???用25升稀釋后的疫苗浸泡50尾成魚(幼魚可浸泡80尾)，

???浸泡時間為5分鐘左右。

疫苗免疫使用中，可根據現場具體情況選擇A或B。顯然本發明制備的滅活疫苗實用性強，制作和投予使用都簡單合理，且免疫效果好，將廣泛使用于海水養魚場中，為我國海水魚養殖事業的發展、尤其魚類疾病防治做出新貢獻。