[發(fā)明專利]重組人表皮生長因子、其制備方法和藥物組合物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00127953.X
• 申請日: 2000-12-19
• 公開（公告）號: CN1360022A
• 公開（公告）日: 2002-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 甘人寶;李載平;錢悅;黃培勇;張倩;杜鵬;馮寶山;丁紅珍;高翔;丁晨;周慶瑋;范晉江;張愛寶
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/63;C07K14/485;A61K38/18;A61P1/04
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 章鳴玉

1.工程菌株EE-8，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為No.02787-1。

2.重組人表皮生長因子的制備方法，包括以下步驟：

用大腸桿菌偏愛的密碼子構(gòu)建和克隆合成的hEGF基因；

構(gòu)建和克隆堿性磷酸酯酶啟動基因和信號肽序列基因片段phoA-P+sig；

構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAE-8；

用表達(dá)質(zhì)粒pAE-8轉(zhuǎn)化宿主菌并篩選得到工程菌株EE-8；

將工程菌EE-8在控制無機(jī)磷含量的Lpi培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)rhEGF。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的大腸桿菌偏愛的密碼子為：

???5’AATTCCGACT?????????CTGAATGCCC????????GCTGTCTCAC

??????GACGGTTACT?????????GCCTACACGA????????TGGTGTTTGC

??????ATGTATATCG?????????AAGCTCTGGA????????CAAATACGCG

??????TGCAACTGTG?????????TTGTTGGTTA????????CATCGGTGAA

??????CGTTGCCAGT?????????ACCGTGACCT????????GAAATGGTGG

??????GAACTGCGT??????????3’

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述表達(dá)質(zhì)粒pAE-8的構(gòu)建步驟是：將所述hEGF基因片段與phoA-P+sig基因片段連接后，再與經(jīng)PstI、Hind?III酶切的pTZ18R質(zhì)粒相連接，轉(zhuǎn)化JM103菌，篩選出表達(dá)質(zhì)粒pAE-8。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述宿主菌為堿性磷酸酯酶缺失的大腸桿菌YK537，其基因特征為：F^-leuB6?thi?hsdR?hsdM?lacy?rpsL20?galk2?ara-14xyl-5?mtl-1?supE44?endl^-phoA8?recA1。

6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述控制無機(jī)磷含量的Lpi培養(yǎng)基的配方如下：

每50ml液體培養(yǎng)基中含(氨芐青霉素鈉最終濃度為100μg/ml)：

Polypepton?????????????0.5g??????????????酵母提取物??????????0.05g

1M?Tris?Cl(pH7.2)????2.5ml?????????????葡萄糖??????????????0.5g??

MgSO₄7H₂O????????????0.05g?????????????飽和酚紅????????????100μl

7.如權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括中試規(guī)模的發(fā)酵和分離純化工藝，發(fā)酵培養(yǎng)基含Polypepton2％、酵母提取物1％、無水硫酸鎂0.05％、無水葡萄糖3％及磷酸鹽緩沖劑，工程菌種子液經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后按2％比例接種于100升發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃發(fā)酵18小時后進(jìn)行高速離心、超濾濃縮和色譜分離。

8.一種治療消化道潰瘍用的藥物組合物，包含人表皮生長因子或其衍生物和藥學(xué)上可接受的輔料，其中所述人表皮生長因子或其衍生物的含量為0.001-2000μg/ml或0.001-2000μg/g。

9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述的藥學(xué)上可接受的輔料為糊精、羥丙基甲基纖維素和卡波姆。

10.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其劑型為膠囊。