[發明專利]高獲得率提取替曲朵辛的方法

無效

• 申請號: 00124516.3
• 申請日: 2000-09-18
• 公開（公告）號: CN1343669A
• 公開（公告）日: 2002-04-10
• 發明（設計）人: 周茂青;沈希光
• 申請（專利權）人: 威克斯醫療儀器有限公司
• 主分類號: C07D491/18
• 分類號: C07D491/18;//;23500;31900;31100)
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 過曉東

本發明涉及一種能以高獲得率從河豚魚內部組織(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。

替曲朵辛屬于小分子非蛋白的高活性神經毒素，主要存在于河豚魚的卵巢、肝臟和血液中，其它部分含量極微。TTX也在其它動物甚至海藻中發現，包括蜥蜴，加州蠑螈，虎蝦魚，藍環章魚等。替曲朵辛化學名是：八氫-12-(羥甲基)-2-亞氨基-5，9：7，10?α-二甲橋-10αH-[1，3]二橋氧并[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇分子式：C₁₁H₁₇N₃0₈分子量：319.27其結構式為：TTX的結構特征是：僅有一個碳環，一個胍基，六個羥基和-個半醛糖內酯基團。純的″替曲朵辛″是無色的結晶粉末。加熱到220℃結晶變暗沒有分解。″替曲朵辛″溶于酸性水溶液，不溶于水及有機溶劑：在水溶液中的Pka為8.76，屬于堿性動物生物堿。在中性或有機酸性溶劑中對熱相當穩定，在強酸和強堿性水溶液中迅速破壞。

用高壓液相法分離、測定的天然河豚魚中的毒素是含有10余種類似物的混合物，其中主要成分叫″替曲朵辛″它的含量在70％-80％之間。另外三種主要類似物為河豚酸、4一表替曲朵辛和脫水4一表替曲朵辛。這三個″替曲朵辛″的化學性質，有些微小的差別，但生物活性差別較大，例如它們的毒性，TTX的毒性為4500鼠單位/毫克，4-表替曲朵辛″的毒性僅為710鼠單位/毫克，而脫水4去4替曲朵辛″的毒性降低到92鼠單位/毫克(Toxicon，23?271-7276(1985))。

獲取TTX的方法有2種，即人工合成和生物提取。1975年日本山口大學農業化學系的岸義人等人成功地合成了外消旋TTX。對TTX的生物提取始于本世紀初的1909年，日本人田原(J.pharm-soc.Japan?22?587(1909)，Biochem-z.30255，1911)用醋酸鉛與氨水處理河豚魚卵巢，得到了毒力為4.1γ(對1克小鼠平均極限致死量表示為MLD4.1γ/g，簡寫為4.1γ)的粗品，并將其命名為現在使用的″Tetrodotoxin″。在以后兒十年中，又出現了多種提取方法，有代表性的如：

橫尾在1950年(日本化學雜志71?590，1950)用水浸取其卵巢，蒸干，得到于物質后，用醋酸鉛與氨水使毒素共同沉淀，用磷鎢酸，苦味酸汞除去不純物，用苯肼除糖，再用苦味酸汞處理，最后依次用苦酮酸、甲醇、苦酮酸再處理，從20公斤卵巢中僅獲得MLD0.8的結晶毒素13mg。

永井1951年(福岡醫志經1(1954))第一次使用離子交換樹脂AmberliteIRe-50吸附毒素，用鹽酸洗脫，再用Amberlite?IR-4B除去鹽酸，濃縮后用無水乙醇提取毒素，最后從20公斤卵巢中得到MLD?0.008r的毒素結晶2.5mg。

1952年，津田與河村搞了一個用活性炭層析的大規模生產法(津田，化學的η領域，增刊，80?9(1967))，可以處理1000公斤卵巢并獲得MLD?10μg/kg的毒素10克。在此同時，美國哈佛大學的Woodward(R.B.Woodward，Pure?Appl.chem..9249-74(1964))也獲得類似的結果。

1964年後藤俊夫等(後藤俊夫、高橋等，日本化學雜志85?508，1964)使用離子交換和活性炭吸附的提純方法，從100公斤卵巢可以獲得他們稱的粗毒素1-2克，使得率有了明顯的提高。其工藝流程見圖1.。

1980年代后，陸續有學者報導了一些新的提取方法，迄今為止發表的提取方法不少于十幾種，但得率并沒有大的提高，僅為100公斤卵巢中提取TTX?1-2g。而本專利申請的提取方法，可以從100公斤卵巢中提取TTX?4-6g，得率高出已有方法的3倍。其工藝流程見圖2.。

″替曲朵辛″(簡稱TTX)結晶品提取采用如圖1所示工藝流程操作。

1.水浸取過程

取河豚魚有毒性的卵巢數十公斤，絞碎為小于1厘米的碎塊，放置于浸取一過濾裝置中，加入1∶1.5的去離子水，為了使TTX更好地從卵巢中浸取出，加入卵巢重量0.1-1％的乙酸。開動攪拌，在室溫攪拌數小時，停止攪拌，然后開動真空泵減壓過濾，數分鐘后，開動壓縮機，讓浸取一過濾裝置上部壓力達到0.5-1公斤/平方厘米。收集濾液，快速加熱至70-95℃，加熱時間3-25分鐘，冷卻后過濾出析出的蛋白，得黃色透明液體，稱為第一次浸取清液。