[發明專利]用于疫苗的活減毒細菌

無效

• 申請號: 00121980.4
• 申請日: 2000-06-09
• 公開（公告）號: CN1325731A
• 公開（公告）日: 2001-12-12
• 發明（設計）人: P·S·科恩;D·C·勞克斯;P·J·M·努杰恩
• 申請（專利權）人: 阿克佐諾貝爾公司;羅得島大學
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61P31/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

本發明涉及用于一種藥劑的活減毒細菌、基于對預防微生物致病機制有用的細菌而產生的疫苗、攜帶異源基因的活減毒細菌以及這些疫苗和細菌的制備方法。

溫血動物戰勝微生物致病的方式是一個復雜的過程。對微生物引起的疾病的免疫是溫血動物避免發病或遭受不強烈致病的一種方式。當群體接觸病原體時，對所給病原菌的不完全免疫引起發病和致死。一般認為基于活減毒微生物的疫苗(活減毒疫苗)誘導一種高效型的免疫應答。這種疫苗有個優點，一旦動物宿主被接種疫苗，進入宿主的微生物病原菌誘導一個早期的細胞介導的或體液免疫的加速的回憶，其可以在感染呈現臨床的顯著比例之前控制微生物的進一步生長。基于死病原菌的疫苗(死疫苗)一般來說不能獲得這種類型的免疫應答。然而，含活致病菌的疫苗，依賴于減毒的水平，會出現這樣的危險，即，接種宿主在預防接種后可能患人們試圖抵抗的疾病。因此，人們希望得到具有活微生物的免疫屬性但不會在預防接種后引起不希望的副作用的疫苗。

細菌減毒的基本方法是去除一個或多個毒性因子。然而在大多數的情況下，毒性因子也在誘導免疫方面起到重要的作用。在那些情況下，毒性因子的缺失不可避免地削弱了細菌的免疫原性能力。這當然是一種不希望的情形。活疫苗優選地應保留野生型菌株的抗原成份。

此外，活疫苗應有充分的a-毒力以避免不可接受的病理學作用，但另一方面，其必須引起宿主足夠水平的免疫。最后，減毒活疫苗菌株最好應該基本上沒有回復為毒力野生型菌株的可能性。

現在令人驚奇地發現一個編碼已知在許多細菌屬的主要碳水化合物的代謝中起作用的蛋白質的基因可被缺失，引起在體內的減毒行為而沒有減弱這些細菌在體內的生存力。這種基因被缺失的細菌的確出人意料地顯示出一種減毒特征。此外，因為編碼的蛋白質在免疫的誘導中不起什么作用，被缺失這種基因的細菌的抗原負載和野生型的相同。因此，這種細菌可出人意料地被優先應用于藥劑制備的領域。更為具體地是用于活減毒疫苗的制備。

本發明所指可以被缺失并導致缺失突變體的體內減毒行為的基因以前被稱為fruR基因，然而現在稱為cra基因。已知缺少這個基因的突變體可在體外生長，但僅當由缺乏cra活性而導致的缺陷被生長培養基所補償時才能生長。這意味著cra缺失突變體可以賴于生長的營養成分必須存在于生長培養基中。

一般地說，致病菌可自我支持是指其代謝能夠適應可利用的營養物。在許多的主要代謝途徑中(如下所示)cra基因起著這樣一種適應性作用。然而cra基因已被缺失的突變體可依靠葡萄糖和許多其它作為碳源的糖很好地生長。在宿主動物中，這樣的糖是可以利用的，因此人們不會期望cra基因在體內的條件下是有功能的。因此，人們不會料到cra缺失的突變體在宿主中顯示出減毒特性。這就解釋了為什么盡管這些突變體是本領域技術人員公知的但卻從來沒有人揭示其作為減毒活疫苗候選者的潛力。

本發明的一個實施方案涉及到用于疫苗的活減毒細菌，其由于Cra基因的突變導致不再能表達一種功能性的Cra蛋白。

基因產物(以前稱為FruR；果糖阻抑蛋白)，現在也稱為Cra(分解代謝物阻抑/激活蛋白)，是在許多碳水化合物代謝主要途徑中的調節蛋白。

cra基因產物Cra調節著主要的碳代謝。更為具體地是，Cra通過結合編碼生物合成酶和氧化酶(例如：TCA循環、乙醛酸支路、葡糖異生途徑以及電子轉移中的關鍵酶)的基因的啟動子上游區正調節這些基因的轉錄，負調節編碼糖酵解酶(例如：EM途徑和ED途徑中的關鍵酶)的基因的轉錄。

由于它在碳水化合物代謝中的關鍵地位，cra基因及其基因產物Cra廣泛地存在于細菌中。Cra蛋白是一種高度保守的蛋白。例如，它可以存在于大腸桿菌，腸沙門氏菌例如鼠傷寒，腸炎以及都柏林血清型，放線桿菌屬例如大葉性肺炎放線桿菌，嗜血桿菌屬例如副雞嗜血桿菌，殺鮭氣單胞菌屬、巴斯德氏菌屬例如條魚巴斯德氏菌，以及多殺巴斯德氏菌，鏈球菌屬例如馬鏈球菌、豬鏈球菌，耶爾森氏菌屬例如鼠疫耶爾森氏菌。