[發(fā)明專利]一種新的多肽——NAD－依賴的2－羥酸脫氫酶家族蛋白11和編碼這種多肽的多核苷酸

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00116661.1
• 申請日: 2000-06-21
• 公開（公告）號: CN1329019A
• 公開（公告）日: 2002-01-02
• 發(fā)明（設計）人: 毛裕民;謝毅
• 申請（專利權(quán)）人: 上海博德基因開發(fā)有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K14/435;C07K16/00;C07K16/18;C07H21/00;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/12;C12N15/63;C12N15/64;C12P21/00;C12Q1/68;G01N33/68;A61K38/16;A61K38/17;A61K31/7088;A61K39/395;A61P35/00;A61P7/00;A61P37/00;A61P31/00;A61P31/18
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本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽——NAD-依賴的2-羥酸脫氫酶家族蛋白11，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。

真核類細菌及植物中有一系列NAD-依賴的對其底物的D-同分異構(gòu)體顯示特異性的2-羥酸脫氫酶，它們催化一些重要的代謝步驟，在功能及結(jié)構(gòu)上相關，被歸為一個家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的種類如下所列：

1)D-乳酸脫氫酶，一種催化D-乳酸還原為丙酮酸的細菌酶類。

2)D-甘油酸脫氫酶(NADH-依賴的羥基丙酮酸還原酶)，一種催化羥基丙酮酸還原為甘油酸特異的植物葉子過氧化物酶體的酶。該反應是光呼吸的乙醇酸途徑中的一部分。

3)細菌Hyphomicrobium?methylovorum及Methylobacterium?extorquens的D-甘油酸脫氫酶。

4)3-磷酸甘油酸脫氫酶，一種催化D-3-甘油酸氧化成3-磷酸羥基丙酮酸的細菌酶類。該反應是絲氨酸生物合成的‘磷酸化’途徑中的第一個關鍵步驟。

5)Erythronate-4磷酸脫氫酶(基因pdxB)，一種參與吡哆醇(維生素B6)生物合成的細菌酶類。

6)D-2-羥基異己醛(D-hicDH)，一種催化2-酮羧酸及D-2-羥基羧酸間可逆兼立體特異的互相轉(zhuǎn)換的細菌酶類。

7)甲酸脫氫酶(FDH)，來自細菌甲單胞桿菌sp-101以及不同的真菌。

8)萬古霉素抗性蛋白，來自腸道球菌faecium；該蛋白是一種參與形成不被D-丙氨酸終止的肽聚糖從而阻止萬古霉素結(jié)合的D-特異性α-酮酸脫氫酶。

9)大腸桿菌假擬蛋白ycdW。

10)大腸桿菌假擬蛋白yiaE。

11)流感嗜血桿菌假擬蛋白HI1556。

12)酵母假擬蛋白YER081w。

13)酵母假擬蛋白YIL074w。

該家族成員有許多共同點：都作用于羥酸D-同分異構(gòu)體；NAD結(jié)合域較為相似，催化域作用特異性底物，因而各有不同；具有相同的NAD結(jié)合域結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為βαβ-折疊，序列為[LIVMA]-[AG]-[IVT]-[LIVMFY]-[AG]-x-G-[NHKRQGSAC]-[LIV]-G-x(13，14)-[LIVfMT]-x(2)-[FYwCTH]-[DNSTK]，十分保守，富含甘氨酸；結(jié)合的輔酶自脫輔基形式轉(zhuǎn)換為完整形式，該家族成員都會發(fā)生構(gòu)像改變，但具體情況各不相同；它們的催化效果一致，封閉底物裂縫及防止酶活性中心被溶解(從脫輔基到完整的構(gòu)像轉(zhuǎn)換)，集中活性位點以及定位與煙酰胺的催化C-4位置有關的功能氨基酸殘基，催化域的轉(zhuǎn)動致使通過多肽鏈的羧基端部分自大量溶劑中有效篩選NAD⁺，而封閉活性位點的第二個入口致使煙酰胺部分的C-4原子附近的重要催化殘基被有效取代，所有NAD⁺依賴的脫氫酶催化的一個重要因素即增強輔酶煙酰胺部分的C4N親電子性，這可通過與帶負電配基相互作用且由于氨甲酰基團對吡啶平面扭曲而干擾其基態(tài)的NAD⁺氨甲酰基團足夠的極化而得到，在NAD⁺依賴的脫氫酶中這樣輔酶的氨甲酰基團位于平面之外十分普遍。

綜上所述該家族成員都具有相同的酶活性，且結(jié)構(gòu)上具相關性。我們選擇了最為保守區(qū)域中的三個區(qū)域以開發(fā)模板。其中第一個模扳即上面所說的與NAD結(jié)合域相關，位于中心部位的富含甘氨酸的區(qū)域。另外兩個模板位于催化域，含有一些保守的帶電殘基，其中有的可能在催化機制中起作用，其序列分別為[LIVMFYWA]-[LIVFYWC]-x(2)-[SAC]-[DNQHR]-[IVFA]-[LIVF]-x-[LIVF]-[HNI]-x-P-x(4)-[STN]-x(2)-[LIVMF]-x-[GSD]與[LMFATC]-[KPQ]-x-[GSTDN]-x-[LIVMFYWR]-[LIVMFYW](2)-N-x-[STAGC]-R-[GP]-x-[LIVH]-[LIVMC]-[DNV]，大腸桿菌D-乳酸脫氫酶(基因為dld)中不含有后一種序列，該酶是一種膜結(jié)合FDA黃素酶。前一種序列由組氨酸/羧化/精氨酸構(gòu)成一個保守的催化域，緊靠該家族成員脫輔基酶的活性位點，并位于完整形式的煙酰胺環(huán)的附近。后一種序列中的天冬氨酸-組氨酸形成一個保守的催化對。