[發明專利]一種新的多肽——二氫吡啶二羧酸脫氫酶21和編碼這種多肽的多核苷酸

無效

• 申請號: 00116339.6
• 申請日: 2000-06-05
• 公開（公告）號: CN1327057A
• 公開（公告）日: 2001-12-19
• 發明（設計）人: 毛裕民;謝毅
• 申請（專利權）人: 上海博德基因開發有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/63;C07K16/40;C12Q1/32;C12Q1/68;A61K38/44
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本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明描述了一種新的多肽——二氫吡啶二羧酸脫氫酶21，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。

二氫吡啶二羧酸脫氫酶(DHDPS)催化賴氨酸以及二氨基庚二酸生物合成的第一個反應步驟。DHDPS通過乒乓機制催化天門冬氨酸半醛和丙酮酸的濃縮，在這個機制中，丙酮酸和一個賴氨酸殘基首先形成一個西佛堿與酶結合，然后結合天門冬氨酸半醛。有其它三個蛋白在結構上與DHDPS相關，而且很可能以同一個接觸反應的機制起到作用：

1.大腸桿菌N-乙酰神經酰胺裂合酶(gene?nanA)，催化N-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸的濃縮合成N-乙酰神經酰胺。

2.根瘤菌的草木犀蛋白mosA，與根霉促進素3-氧-甲基-scyllo-肌胺霉的生物合成相關。

3.大腸桿菌推測蛋白yjhH。

已經替這些酶確認了兩種信號模式。第一種是以蛋白N末端的高度保守區域為中心的。第二種信號包含一個大腸桿菌中二氨基庚二酸合成時的賴氨酸殘基，作為形成西佛堿的反應物。

二氫吡啶二羧酸脫氫酶在高等植物和很多細菌中(二氨基庚二酸基因genedapA)都存在，是賴氨酸以及二氨基庚二酸生物合成的第一個反應步驟。

大腸桿菌二氫吡啶二羧酸脫氫酶是賴氨酸生物合成特異的，以乒乓機制催化丙酮酸和天門冬氨酸β-半醛(ASA)的縮合。丙酮酸首先和賴氨酸的ε-氨基酸基團結合形成西佛堿，與酶結合，然后結合ASA。K_m在0.57-0.55mM之間，決定于丙酮酸和DL-ASA。3-溴-丙酮酸在K_i是1.6mM時抑制DHDPS，DHDPS活性僅50％。1.0mM的L-賴氨酸，1.2mM的吡啶二羧酸鈉或4.6mM的S-2-氨乙基-L-半胱氨酸都抑制DHDPS活性。

小麥的DHDPS和大腸桿菌的DHDPS有30％同源，其中一個克隆的cDNAs已與E.coli的DHDPS轉錄和翻譯信號融合，E.coli的基因互補鏈缺乏內源DHDPS活性。而且，野生E.coli中小麥DHDPS?cDNA的表達在轉化的細菌中使酶的活性增強10倍。

另一個與gene?dapA相關的基因是根瘤菌的草木犀L5-30基因群位點，編碼根霉促進素3-氧-甲基-scyllo-肌胺霉，是一個鑲嵌結構。此基因位點群由安排了一個操縱子(ORF1和MosABC)的四個讀框組成。在這個位點中，存在幾個具有其它原核共生基因(nifH，fixA，fixU，和nifT)的幾個同源基因域，據此推測這個位點可能表現一個共生基因重排的熱點。通常這些基因域在基因群位點的編碼和非編碼區域都存在。MosABC而不是ORF1啟動的基因編碼的蛋白通過抗體在結瘤抽提物中發現。因為ORF1顯示出與nifH基因的5’端和一個移碼突變具廣泛的同源說明這個讀框的表達不需要位點的活化，實驗者推測這個基因群位點獲得了一個nifH的復制文本，包括進行共生調節的啟動子。令人驚訝的是，盡管看上去結構不同，MosA有一段與大腸桿菌的DapA蛋白序列相似的氨基酸序列。MosB的中心區域和一組不同的蛋白有廣泛的同源，這些蛋白在抗菌或細胞外生物合成上與糖代謝有關。這些區域在調節蛋白DegT和DnrJ上是共有的，據認為是MosB的一個調節位點。MosC的結構是與其作為一種膜轉運蛋白一致的。

由于二氫吡啶二羧酸脫氫酶是生物合成賴氨酸和二氨基庚二酸所必需的酶，因此對于研究和治療賴氨酸缺乏癥有重要作用，同時對于研究生化代謝途徑中賴氨酸及其衍生物和二氨基庚二酸的作用也有幫助。

由于DHDPS催化丙酮酸和ASA縮合的反應，而賴氨酸要參與其中，可以利用這個反應的進行程度推測肽鏈中賴氨酸的含量。

該酶的特征保守序列是：1：[GSA]-[LIVM]-[LIVMFY]-x(2)-G-[ST]-[TG]-G-E-[GASNF]-x(6)-[EQ]2：Y-[DNS]-[LIVMF]-P-x(2)-[ST]-x(3)-[LIVM]-x(13，14)-[LIVM]-x-[SGA]-[LIVMF]-K-[DEQAF]-[STAC]其中K與Schiff緘的形成有關